Solo haz el escaneo espectrofotómetro

Hay dos tipos principales de dispositivos: haz simple y doble haz. Un espectrofotómetro de doble haz compara la intensidad de la luz entre dos trayectorias luminosas, una que contiene una muestra de referencia y la otra la muestra de ensayo. Un espectrofotómetro de un solo haz mide la intensidad luminosa relativa del haz antes y después de insertar una muestra de ensayo. Aunque las mediciones de comparación de instrumentos de doble haz son más fáciles y estables, los instrumentos de un solo haz pueden tener un rango dinámico más grande y son ópticamente más simples y compactos. Además, algunos instrumentos especializados, como los espectrofotómetros integrados en microscopios o telescopios, son instrumentos de un solo haz debido a su practicidad.

Históricamente, los espectrofotómetros utilizan un monocromador que contiene una rejilla de difracción para producir el espectro analítico. La rejilla puede ser móvil o fija. Si se utiliza un solo detector, como un tubo fotomultiplicador o un fotodiodo, la rejilla se puede escanear paso a paso (espectrofotómetro de escaneo) para que el detector pueda medir la intensidad de la luz en cada longitud de onda (que corresponderá a cada «paso»). También se pueden utilizar conjuntos de detectores (espectrofotómetro de conjuntos), como dispositivos de acoplamiento de carga (CCD) o conjuntos de fotodiodos (PDA). En tales sistemas, la rejilla es fija y la intensidad de cada longitud de onda de luz es medida por un detector diferente en el conjunto. Además, la mayoría de los espectrofotómetros modernos de infrarrojo medio utilizan una técnica de transformada de Fourier para adquirir la información espectral. Esta técnica se denomina espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier.

Al realizar mediciones de transmisión, el espectrofotómetro compara cuantitativamente la fracción de luz que pasa a través de una solución de referencia y una solución de prueba, luego compara electrónicamente las intensidades de las dos señales y calcula el porcentaje de transmisión de la muestra en comparación con el estándar de referencia. Para las mediciones de reflectancia, el espectrofotómetro compara cuantitativamente la fracción de luz que refleja de las muestras de referencia y de prueba. La luz de la lámpara de fuente pasa a través de un monocromador, que difracta la luz en un «arco iris» de longitudes de onda a través de un prisma giratorio y emite anchos de banda estrechos de este espectro difractado a través de una ranura mecánica en el lado de salida del monocromador. Estos anchos de banda se transmiten a través de la muestra de ensayo. A continuación, la densidad de flujo de fotones (vatios por metro cuadrado generalmente) de la luz transmitida o reflejada se mide con un fotodiodo, un dispositivo de carga acoplada u otro sensor de luz. A continuación, se compara el valor de transmitancia o reflectancia para cada longitud de onda de la muestra de ensayo con los valores de transmisión o reflectancia de la muestra de referencia. La mayoría de los instrumentos aplicarán una función logarítmica a la relación de transmitancia lineal para calcular la «absorbencia» de la muestra, un valor que es proporcional a la «concentración» del producto químico que se está midiendo.

En resumen, la secuencia de eventos en un espectrofotómetro de escaneo es la siguiente:

1. La fuente de luz se ilumina en un monocromador, se difracta en un arco iris y se divide en dos haces. Luego se escanea a través de la muestra y las soluciones de referencia.
2. Las fracciones de las longitudes de onda incidentes se transmiten a través de la muestra y la referencia o se reflejan en ella.
3. La luz resultante golpea el dispositivo fotodetector, que compara la intensidad relativa de los dos haces.
4. Los circuitos electrónicos convierten las corrientes relativas en porcentajes de transmisión lineal y/o valores de absorbancia / concentración.

En un espectrofotómetro de matriz, la secuencia es la siguiente:

1. La fuente de luz se ilumina en la muestra y se enfoca en una hendidura
2. La luz transmitida se refracta en un arco iris con la rejilla de reflexión
3. La luz resultante golpea el dispositivo fotodetector que compara la intensidad del haz
4. Los circuitos electrónicos convierten las corrientes relativas en porcentajes de transmisión lineal y/o valores de absorbancia/concentración

Muchos espectrofotómetros más antiguos deben calibrarse mediante un procedimiento conocido como «puesta a cero», para equilibre la salida de corriente nula de los dos haces en el detector. La transmisión de una sustancia de referencia se establece como valor de referencia (datum), de modo que la transmisión de todas las demás sustancias se registra en relación con la sustancia «puesta a cero» inicial. A continuación, el espectrofotómetro convierte la relación de transmisión en «absorbencia», la concentración de componentes específicos de la muestra de ensayo en relación con la sustancia inicial.

Aplicaciones en bioquímicaedItar

La espectrofotometría es una técnica importante utilizada en muchos experimentos bioquímicos que involucran aislamiento de ADN, ARN y proteínas, cinética enzimática y análisis bioquímicos. Dado que las muestras en estas aplicaciones no están fácilmente disponibles en grandes cantidades, son especialmente adecuadas para ser analizadas en esta técnica no destructiva. Además, la muestra preciosa se puede guardar utilizando una plataforma de microvolumen donde se requiere tan solo 1uL de muestra para análisis completos. Una breve explicación del procedimiento de espectrofotometría incluye comparar la absorbencia de una muestra en blanco que no contiene un compuesto coloreado con una muestra que contiene un compuesto coloreado. Esta coloración se puede lograr mediante un tinte como el colorante Azul brillante de Coomasia G-250 medido a 595 nm o mediante una reacción enzimática como se ve entre la β-galactosidasa y el ONPG (vuelve la muestra amarilla) medido a 420 nm.: 21-119 El espectrofotómetro se utiliza para medir compuestos coloreados en la región visible de luz (entre 350 nm y 800 nm),:65 por lo tanto, se puede usar para encontrar más información sobre la sustancia en estudio. En experimentos bioquímicos, se elige una propiedad química y/o física y el procedimiento que se utiliza es específico de esa propiedad para obtener más información sobre la muestra, como la cantidad, la pureza, la actividad enzimática, etc. La espectrofotometría se puede utilizar para una serie de técnicas, como determinar la absorbancia óptima de longitud de onda de las muestras, determinar el pH óptimo para la absorbancia de las muestras, determinar las concentraciones de muestras desconocidas y determinar el pKa de varias muestras.:La espectrofotometría 21-119 también es un proceso útil para la purificación de proteínas y también se puede usar como método para crear ensayos ópticos de un compuesto. Los datos espectrofotométricos también se pueden usar junto con la ecuación de Beer-Lambert, A = − log 10 ⁡ T = c c l = O D {\textstyle A=-\log _{10}T=\epsilon cl=OD}

, para determinar varios relaciones entre transmitancia y concentración, y absorbancia y concentración.:21-119 Debido a que un espectrofotómetro mide la longitud de onda de un compuesto a través de su color, se puede agregar una sustancia de unión de tinte para que pueda experimentar un cambio de color y medirse. Es posible conocer las concentraciones de una mezcla de dos componentes utilizando los espectros de absorción de las soluciones patrón de cada componente. Para ello, es necesario conocer el coeficiente de extinción de esta mezcla a dos longitudes de onda y los coeficientes de extinción de las soluciones que contienen los pesos conocidos de los dos componentes. Los espectrofotómetros se han desarrollado y mejorado durante décadas y se han utilizado ampliamente entre los químicos. Además, los espectrofotómetros están especializados para medir los valores de absorbancia de longitud de onda de luz UV o visible.: 21-119 Se considera un instrumento de alta precisión que también es muy sensible y, por lo tanto, extremadamente preciso, especialmente para determinar el cambio de color. Este método también es conveniente para su uso en experimentos de laboratorio porque es un proceso barato y relativamente simple.