Realización de HPLC

Introducción

La cromatografía líquida de alto rendimiento es básicamente una forma altamente mejorada de cromatografía en columna. En lugar de permitir que un solvente gotee a través de una columna bajo gravedad, es forzado a través de altas presiones de hasta 400 atmósferas. Eso lo hace mucho más rápido.

También le permite utilizar un tamaño de partícula mucho más pequeño para el material de embalaje de la columna, lo que proporciona una superficie mucho mayor para las interacciones entre la fase estacionaria y las moléculas que fluyen más allá de ella. Esto permite una separación mucho mejor de los componentes de la mezcla.

La otra mejora importante con respecto a la cromatografía de columna se refiere a los métodos de detección que se pueden utilizar. Estos métodos son altamente automatizados y extremadamente sensibles.

La columna y el disolvente

Confusamente, hay dos variantes en uso en HPLC dependiendo de la polaridad relativa del disolvente y la fase estacionaria.

HPLC de fase normal

Esto es esencialmente lo mismo que ya habrá leído en cromatografía de capa delgada o cromatografía de columna. Aunque se describe como «normal», no es la forma de HPLC más utilizada.

La columna está llena de pequeñas partículas de sílice, y el disolvente es hexano no polar, por ejemplo. Una columna típica tiene un diámetro interno de 4,6 mm (y puede ser menor que eso), y una longitud de 150 a 250 mm.

Los compuestos polares en la mezcla que se pasa a través de la columna se pegarán más a la sílice polar que los compuestos no polares. Por lo tanto, los no polares pasarán más rápidamente a través de la columna.

HPLC de fase inversa

En este caso, el tamaño de la columna es el mismo, pero la sílice se modifica para hacerla no polar al unir largas cadenas de hidrocarburos a su superficie, típicamente con 8 o 18 átomos de carbono en ellas. Se utiliza un solvente polar, por ejemplo, una mezcla de agua y un alcohol como el metanol.

En este caso, habrá una fuerte atracción entre el disolvente polar y las moléculas polares en la mezcla que se pasa a través de la columna. No habrá tanta atracción entre las cadenas de hidrocarburos unidas a la sílice (la fase estacionaria) y las moléculas polares en la solución. Por lo tanto, las moléculas polares de la mezcla pasarán la mayor parte de su tiempo moviéndose con el disolvente.

Los compuestos no polares en la mezcla tenderán a formar atracciones con los grupos de hidrocarburos debido a las fuerzas de dispersión de van der Waals. También serán menos solubles en el disolvente debido a la necesidad de romper los enlaces de hidrógeno a medida que se aprietan entre las moléculas de agua o metanol, por ejemplo. Por lo tanto, pasan menos tiempo en solución en el disolvente y esto los ralentizará en su camino a través de la columna.

Eso significa que ahora son las moléculas polares las que viajarán a través de la columna más rápidamente.

La HPLC de fase inversa es la forma de HPLC más utilizada.