Marco algorítmico ACsN

ACsN combina calibración de cámara, estimación de ruido y filtrado disperso para corregir las fuentes de ruido más relevantes generadas por una cámara sCMOS (Fig. 1a y Notas complementarias 1 y 2.1). En particular, ACsN corrige primero el ruido de patrón fijo utilizando un mapa del desplazamiento y la ganancia de los píxeles de sCMOS. La presencia del ruido de patrón fijo en las cámaras sCMOS genera en diferentes píxeles (p) un número diferente de fotoelectrones del mismo número de fotones de impacto (Sp). Este efecto es proporcional al nivel de iluminación y se puede modelar como un factor multiplicativo yp aplicado al parámetro de la variable distribuida por Poisson Sp. Al mismo tiempo, durante la conversión analógica a digital (AD), el voltaje producido por cada píxel se lee como la diferencia con respecto a un nivel de referencia, que representa la ausencia de luz. En la práctica, a esta tensión de referencia se le asigna un valor positivo que es responsable de un sesgo (ßp) en los valores de intensidad medidos. Por lo tanto, la adquisición de una cámara sCMOS se puede modelar mediante la ecuación:20

donde Zp es el valor del píxel p, τ el tiempo de exposición, y N (0, σR) el ruido de lectura distribuido gaussiano de µR medio = 0 y desviación estándar σR. Teniendo en cuenta la practicidad de la microscopía de fluorescencia, en este modelo hemos omitido la contribución de la corriente oscura, que puede descartarse para tiempos de exposición inferiores a 1 s, y el ruido de cuantización debido a la conversión de ANUNCIO, que es insignificante en comparación con el ruido de lectura 3,21 (Nota complementaria 2.2).

un Concepto de la ACsN algoritmo. La imagen de entrada se escala con la ganancia de píxeles y los mapas de desplazamiento de la cámara para eliminar el ruido de patrón fijo (FP). A continuación, utilizando los parámetros experimentales, se calcula el límite del OTF y se utiliza para producir una imagen filtrada de paso alto, a partir de la cual se obtiene la estimación del ruido (NE). Finalmente, se realiza un filtrado disperso (SF) para generar la imagen desprovista de espacio. b Comparación de las variaciones de ruido antes (cuadrados grises) y después (círculos rojos) corrección de ruido. Todos los datos se dividieron por el valor esperado para el ruido puro de Poisson. La línea discontinua representa el rendimiento ideal de la cámara. Para generar esta gráfica se utilizaron tres conjuntos diferentes de imágenes de microtúbulos de HeLa. Las barras de error representan la desviación estándar temporal (STD) evaluada en más de 100 imágenes. mapas de fluctuación c, d, es decir, STD evaluados en más de 100 imágenes de sCMOS adquiridas a un tiempo de exposición de 10 ms antes (c) y después (d) de la eliminación de la señal ACsN. Las intensidades se expresan en unidades analógicas a digitales (ADU). e, f Imágenes ampliadas de las áreas marcadas por los cuadrados blancos en c y d, respectivamente. g Fluctuación temporal de los valores de intensidad de los píxeles correspondientes a las áreas con círculos (1 y 2) en e y f, respectivamente. Los valores de las imágenes originales y las imágenes eliminadas se representan en gris y rojo, respectivamente. Barras de escala: 500 nm (a), 1 µm (b), 3 µm (d), 300 nm (f).

Dado que el ruido de patrón fijo depende solo de los circuitos de la cámara, ßp y yp se pueden estimar a través de una calibración única (consulte Métodos). Sin embargo, una evaluación cuidadosa tanto del ruido de lectura distribuido gaussiano, N(0, σR), como de la fluctuación debida al ruido de disparo de fotones distribuido por Poisson, Pois{Sp(τ)}, es necesaria para obtener una estimación precisa de la señal subyacente Sp. Para realizar esta evaluación, diseñamos un modelo de ruido que permite una estimación conjunta de la varianza de ruido mediante el análisis de la respuesta de frecuencia del sistema de microscopía. Esto se basa en el hecho de que la distribución de Poisson del ruido de disparo de fotones se puede aproximar de manera factible mediante una distribución gaussiana cuando el flujo de fotones es >3 fotones por pixel22. En particular, el error introducido al aproximar la varianza de Poisson, \(\sigma _P^2\), con una varianza gaussiana, \(\sigma _G^2\), se convierte en <1% cuando el flujo de fotones es más de 5 fotones por píxel (Nota complementaria 2.3). En particular, las condiciones mencionadas anteriormente en el flujo de fotones generalmente se satisfacen para muchas aplicaciones en microscopía de fluorecencia23, 24. Por lo tanto, consideramos el ruido relacionado con la cámara como el resultado de la suma de dos variables aleatorias distribuidas por Gauss independientes, cuya varianza es \(\sigma _N^2 = \sigma _R^2 + \sigma _G^2\). Dicha distribución consiste en una densidad espectral de potencia constante, mientras que las señales procedentes de la muestra están contenidas en la función de transferencia óptica (OTF) 25. Por lo tanto, aprovechamos el conocimiento del sistema óptico para evaluar la fluctuación de píxeles fuera del OTF, que se debe solo al ruido, y luego usamos el valor obtenido para derivar σN en la imagen original (Nota complementaria 2.3).

A continuación, el algoritmo utiliza estas estadísticas de ruido para una evaluación no local de la auto-similitud de la muestra y para realizar un filtrado colaborativo disperso en la secuencia de entrada. A diferencia de implementaciones anteriores de filtrado colaborativo, adoptamos un enfoque por capas que sondea secuencialmente la auto-similitud de la imagen en el espacio y el tiempo para mejorar la corrección de ruido sin sacrificar la precisión y el tiempo de ejecución. En resumen, el filtro descompone la imagen en parches y los clasifica en grupos tridimensionales (3D) de acuerdo con su similaridad26. Luego, emplea una transformación 3D para procesar todos los grupos a la vez. La eliminación de ruido se realiza mediante umbral duro y se ve reforzada por el hecho de que, debido a la similitud entre los parches, la transformación 3D da como resultado una representación aún más escasa de los parches originales, mientras que el espectro de potencia de ruido permanece constante27. Posteriormente, los parches desprovistos se devuelven a sus ubicaciones originales para formar una imagen intermedia. En este punto, el filtro colaborativo se ejecuta por segunda vez, pero reemplazando el umbral mínimo por un filtro Wiener. El filtro se realiza utilizando tanto las imágenes ruidosas como las intermedias y genera la imagen desensibilada final (Nota complementaria 2.4). Cabe señalar que la variación espacial del ruido a lo largo de la imagen puede afectar al rendimiento del filtro Wiener. Sin embargo, esto se ve considerablemente mitigado por el uso de procesamiento basado en parches, que, en comparación con la imagen completa, mejora la uniformidad de intensidad dentro de los grupos de parches individuales, exhibiendo una gran estabilidad contra el ruido de variantes espaciales9.

Finalmente, se realiza otro filtro colaborativo buscando parches similares también en los marcos vecinos. De esta manera, el ruido persistente se puede reducir aún más aprovechando la auto-similitud de la muestra en el tiempo, preservando al mismo tiempo la resolución temporal18 (Nota complementaria 2.5).

Caracterización de ACsN

A continuación, caracterizamos el desempeño de ACsN utilizando datos numéricos y experimentales. En particular, el filtrado colaborativo de ACsN depende de la estimación de σN, así como de la elección de los parámetros en el algorítmo28, que se eligieron para optimizar tanto la corrección de ruido como el tiempo de ejecución (Nota complementaria 3.1). Observamos que nuestra estrategia puede atenuar significativamente el efecto perjudicial del ruido de la cámara, evitando la pérdida de resolución de la imagen, especialmente en presencia de ruido con variantes espaciales elevadas (Nota complementaria 3.2). Además, el ruido de la cámara puede inducir fluctuaciones temporales de los valores de píxeles que no están relacionados con la muestra, lo que afecta al análisis cuantitativo de los datos de lapso de tiempo. La eliminación de ruido ACsN reduce este efecto en aproximadamente un orden de magnitud, con fluctuaciones residuales comparables a las de una cámara ideal (Fig. 1b a g y Nota complementaria 3.3). Además, debe tenerse en cuenta que con recuentos bajos de fotones, los detalles de la muestra comienzan a ser comparables con las fluctuaciones de ruido y se vuelven más difíciles de recuperar. Por lo tanto, el rendimiento de la restauración de imágenes está intrínsecamente relacionado con el flujo de fotones de la imagen de entrada. Sin embargo, utilizando simulaciones y datos experimentales, verificamos una corrección de ruido ACsN robusta a niveles de poca luz de hasta 5-10 fotones por píxel (Nota complementaria 3.4).

Además, validamos el rendimiento de ACsN bajo varias tasas de muestreo normalmente adoptadas para microscopía de fluorescencia. En la práctica, una frecuencia de muestreo cercana al criterio de Nyquist representa un buen equilibrio entre la relación señal / ruido (SNR) y la preservación de los detalles. Aquí, examinando numérica y experimentalmente a través de una amplia gama de frecuencias de muestreo, demostramos la viabilidad de ACsN para SNR bajo con sobremuestreo y sin pérdida notable de señales con submuestreo (Nota complementaria 3.5).

A diferencia de las imágenes naturales, las imágenes fluorescentes de muestras biológicas son altamente especificadas, exhibiendo objetivos moleculares o estructuras en células etiquetadas con precisión. Por lo tanto, cada imagen fluorescente generalmente presenta objetos específicos recurrentes en todo el campo de visión, lo que proporciona suficiente auto-similitud no local para hacer que el algoritmo sea notablemente eficiente para la microscopía de fluorescencia. Con datos numéricos y experimentales, caracterizamos la dependencia del desempeño de ACsN en el uso de la auto-similitud de una imagen de entrada (Nota Complementaria 3.6). Además, como se muestra a continuación, evaluamos cuantitativamente una variedad de muestras no biológicas y biológicas para verificar la viabilidad del método, abarcando diversas dimensiones, morfología, aleatoriedad y densidad, como blancos de calibre, partículas fluorescentes, moléculas individuales, microtúbulos, filamentos de actina, mitocondrias, filopodios, lamelipodios y animales pequeños.

Microscopía de campo amplio

La microscopía de campo amplio, especialmente la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF, por sus siglas en inglés), es una de las técnicas más utilizadas en la creación de imágenes de cellas29. TIRF utiliza el fenómeno de la reflexión interna total de la luz en la interfaz vidrio/agua para crear una onda evanescente que se propaga solo por unos pocos cientos de nanómetros a través del cubreobjetos. Esto permite la excitación selectiva de las etiquetas fluorescentes en la parte inferior de la muestra (Fig. 1a). Sin embargo, en el caso de emisores fluorescentes débiles, poca intensidad de luz o un tiempo de exposición corto, el ruido relacionado con sCMOS se vuelve severo y deteriora la calidad de la imagen (Fig. 1b). La eliminación de ruido de ACsN puede reducir eficazmente dicha contribución y recuperar las señales no distorsionadas del ruido, lo que permite una adquisición más rápida sin comprometer la señal subyacente (Fig. 1c, d).

Se demostró la eliminación de ACsN de microscopía de campo amplio en configuraciones de epi-fluorescencia y TIRF utilizando varias muestras subcelulares fijas, vivas y multicolores, incluidos microtúbulos (Fig. 1 y Suplemento Fig. 1), mitocondrias (Fig. 2 y Películas suplementarias 1 y 2), y actina F (Fig. 2). El uso de ACsN puede mantener la misma calidad de imagen con un tiempo de exposición más corto (es decir, una mejor resolución temporal) y un nivel de excitación más bajo (es decir, menos daños fotográficos). El rendimiento está, por lo tanto, limitado principalmente por la fotofísica de los emisores fluorescentes. Usando métricas cuantitativas, mostramos que el método puede recuperar imágenes de campo amplio con un presupuesto de fotones dos órdenes de magnitud más bajo sin pérdida de calidad de imagen (Tabla complementaria 1).

a Obtención de imágenes por epifluorescencia de mitocondrias en células endoteliales fijas de la arteria pulmonar bovina (BPAE) a un tiempo de exposición de 1 ms. b La misma imagen en a después de la eliminación de ACsN. c-f Imágenes ampliadas de las regiones encajonadas correspondientes en a y b. Los resultados cuantitativos y el análisis se presentan en la Tabla complementaria 1. g Fotograma representativo de un lapso de tiempo de 100 imágenes de mitocondrias en células renales embrionarias humanas vivas (HEK) registradas a 50 Hz (tiempo de exposición: 20 ms). h El marco representativo correspondiente de la secuencia de imágenes (g) obtenida tras el procesamiento ACsN. Las inserciones en g y h muestran imágenes ampliadas de las regiones correspondientes marcadas en la caja blanca discontinua en g. i-n Imágenes ampliadas de las regiones correspondientes marcadas en la caja amarilla sólida en g en diferentes momentos de 200 ms (i, l), 800 ms (j, m) y 1200 ms (k, n). o, p Imagen de doble color, respectivamente, antes (o) y después (p) de la eliminación de ACsN de actina F (cian) y mitocondrias (naranja) en células BPAE fijas obtenidas por microscopía TIRF con un tiempo de exposición de 2 ms. perfiles de intensidad de sección transversal q, r de (o) y (p) a lo largo de la línea discontinua correspondiente en o, respectivamente, que muestran estructuras celulares sustancialmente desnoizadas y mejor resueltas. Barras de escala: 10 µm (b), 3 µm (f), 4 µm (h, p), 1 µm (h, insertado) y (l).

Microscopía de deconvolución y campo de luz

La deconvolución de imágenes se usa ampliamente en microscopía óptica, desde la restauración de imágenes de baja calidad hasta la mejora de técnicas de superresolución 30. Sin embargo, el ruido puede degradar fácilmente el rendimiento de muchos algoritmos comunes al producir artefactos de deconvolución. En cambio, observamos una notable reducción de estos artefactos en imágenes deconvolvidas mediante el empleo de eliminación de ruido ACsN antes de diferentes métodos basados en el algoritmo Richardson–Lucy 31, aprendizaje mecánico32 y fluctuación radial 33 (Nota complementaria 4.1). La mejora de la restauración de imágenes se refleja también en una mejora de la calidad de imagen global, evaluada mediante métricas como el coeficiente de Pearson a escala de resolución (RSP)34. Por ejemplo, combinando ACsN y fluctuación radial, generamos imágenes de superresolución con un mejor valor de RSP a una resolución temporal de hasta dos órdenes de magnitud superior a la reportada actualmente 33 (Fig.Suplementaria. 2).

La deconvolución de imágenes también está en la base de la reconstrucción tridimensional en microscopía de campo de luz (LFM). LFM emplea una matriz de microlentes en un sistema de microscopía para obtener tanto la información espacial bidimensional (2D) como la angular 2D de la luz incidente, lo que permite la reconstrucción computacional del volumen 3D completo de una muestra a partir de un solo marco de camara35. Sin embargo, el proceso de reconstrucción basado en la deconvolución es altamente sensible al SNR, especialmente debido al esquema de imágenes de amplio campo, volumétrico y rápido de LFM. Por esta razón, el uso de ACsN para corregir el ruido en las imágenes raw (Fig. 3a, b) resulta en una mejora claramente notable en las reconstrucciones de campo de luz 3D (Fig. 3c, d). De hecho, la presencia del ruido conduce al cálculo erróneo del objeto 3D o a la propagación de picos no asociados a fluoróforos. El primero afecta al muestreo a lo largo de la dimensión axial y puede resultar en una resolución axial desigual (Fig. 3e, f). Este último produce un fondo adicional que cubre la señal de fluorescencia, perjudicando también la resolución lateral (Fig. 3g-i). Usando ACsN, ambas deficiencias se pueden mitigar, lo que resulta en una representación volumétrica 3D sustancialmente mejorada de las estructuras celulares.

a, b Imágenes de campo de luz sin procesar de microtúbulos en una celda HeLa antes (a) y después (b) del procesamiento ACsN. Las inserciones muestran las imágenes de microlentes ampliadas de las regiones de caja correspondientes, donde el ruido se ha reducido sustancialmente como se ve en b. c, d Imágenes reconstruidas tridimensionales (3D) obtenidas de a y b, respectivamente. La información de profundidad se codifica de acuerdo con la barra de escala de colores. Las inserciones muestran las imágenes ampliadas de las regiones de caja con rayas blancas correspondientes, donde se observa una mejor calidad de imagen y una resolución 3D mejorada después de la eliminación de ruido de ACsN. secciones transversales e, f en el plano YZ correspondientes a las líneas discontinuas rojas en c y d, respectivamente, donde las estructuras de microtúbulos se resuelven mejor con artefactos reducidos utilizando ACsN. g, h Imágenes ampliadas de las regiones de caja sólida roja en c y d, respectivamente, a z = 1,4 µm, donde las estructuras de microtúbulos se resuelven mejor utilizando ACsN. i Perfiles de sección transversal de (g, gris) y (h, rojo) correspondientes a las líneas discontinuas blancas en g, h, respectivamente. Los filamentos cubiertos por ruido de fondo no asociado a fluoróforos se resuelven utilizando ACsN. Barras de escala: 8 µm (b, d), 800 nm (b, insertado), 3 µm (d, insertado), 1 µm (e, g).

Microscopía de localización de una sola molécula

Para validar la viabilidad de ACsN para microscopía de localización de una sola molécula (SMLM)36, realizamos imágenes de TORMENTA de mitocondrias en células HeLa (Fig. 3). El efecto del ruido relacionado con sCMOS en la localización de una sola molécula se puede observar en dos aspectos: la presencia de falsos negativos, debido a la pérdida de moléculas de emisión débil cubiertas por ruido (Fig. 3c, d), y la presencia de falsos positivos, debido a los píxeles calientes o simplemente a la distribución del ruido (Fig. 3e, f). La eliminación del ruido de los datos de una sola molécula en bruto permite la supresión de ambos tipos de errores de localización, lo que resulta en una mejora significativa de la calidad de imagen de TORMENTA y métricas como el RSP y el Error de Escala de resolución (RSE)34 (Fig. 4a, b). Además, esta mejora de la eficiencia de la localización conduce a un mejor contraste y a la aparición de características que no se ven claramente en la reconstrucción sin desenrollarse (Fig. 4c-f). Además, la reducción de las fluctuaciones de píxeles no relacionadas con la muestra permite obtener un mapa de la velocidad de parpadeo de los fluoróforos que se puede usar para aliviar los efectos del etiquetado imperfecto (Fig. 4).

una imagen de TORMENTA de mitocondrias en una célula HeLa fija (RSP: 0.81, RSE: 40.6). imagen DE TORMENTA b reconstruida después de la eliminación de ruido de ACsN de datos de una sola molécula en bruto de a (RSP: 0,85, RSE: 36,7). En ambos casos, se utilizaron 5000 marcos de una sola molécula. Los marcos representativos de los datos brutos antes y después de la eliminación de ruido se muestran en la Fig complementaria. 3. El análisis cuantitativo de imágenes con ARDILLA NanoJ evaluó una mejora de los valores de RSP ( + 0,04) y RSE (-3,9) en b en comparación con a. Se observa que el número de localizaciones en b aumenta en comparación con a, lo que conduce a un mejor contraste en el primero y a la aparición de características no visibles en el segundo (c–f). g Seguimiento de partículas individuales de un cordón fluorescente registrado con un tiempo de exposición de 1 ms. En el recuadro se muestra un marco representativo. Cada color corresponde a una de las seis pistas diferentes detectadas. h Seguimiento de partículas únicas del mismo cordón en g después de la eliminación de partículas ACsN (inserción). El SNR mejorado proporciona una mejor precisión de localización, lo que da como resultado una trayectoria única y suave (línea negra). i Fotograma representativo para el seguimiento de partículas únicas de biplano a una velocidad de fotogramas de 1 kHz (tiempo de exposición: 1 ms) antes (izquierda) y después (derecha) de la eliminación de ruido ACsN. Barras de escala: 4 µm (a), 2 µm (c, e, i), 1 µm (g, insertado), 250 nm (h).

Al igual que la imagen de una sola molécula, la precisión de localización en el seguimiento de una sola partícula (SPT) está estrechamente relacionada con el número de fotones detectados. Por lo tanto, un factor crítico que afecta el rendimiento del SPT es el SNR de los datos de la imagen 37. Demostramos que el ACsN se puede utilizar para minimizar los errores de localización responsables de la identificación errónea de partículas y trayectorias erróneas (Fig. 4g, h y Película complementaria 3). Esta mejora del SNR da como resultado una mejor precisión de localización de partículas, es decir, una mejor estimación del desplazamiento lateral del cordón con sensibilidad subpíxel. Esto puede ser de gran utilidad también en SPT de biplano, donde la precisión del seguimiento 3D depende de la calidad de la imagen desenfocada38 (Fig. 4i, Película Suplementaria 4 y Nota suplementaria 4.2).

Microscopía de fluorescencia con cámaras CMOS de bajo costo

Recientemente, los avances de las cámaras CMOS industriales de gama alta han despertado el interés de la comunidad científica por la posibilidad de abordar el rendimiento de las cámaras sCMOS a un precio más comprable39,40,41,42. Se ha demostrado que estas cámaras CMOS se pueden utilizar para la generación de imágenes SMLM41, 42. Sin embargo, la menor eficiencia cuántica y el mayor ruido de lectura limitan la calidad de imagen y la usabilidad general para la investigación biomédica cuantitativa en muchas áreas. Abordar el desafío con una estrategia de eliminación de ruido adecuada proporcionaría una solución crítica y oportuna para transformar las cámaras de grado industrial para aplicaciones de imágenes más amplias. Aquí, primero implementamos ACsN con una cámara de grado industrial de alta gama para microscopía de campo amplio utilizando iluminación epi y TIRF (Fig. 5a a h). En ambas configuraciones, la eliminación de ruido de ACsN mejoró sustancialmente la calidad de imagen, logrando un acuerdo prominente con las imágenes obtenidas por la cámara sCMOS (Figs suplementarias. 5 y 6, y cuadro complementario 2).

una imagen TIRF de actina F en una celda BPAE fija, tomada a una velocidad de fotogramas de 38 Hz (tiempo de exposición: 26 ms). b La misma imagen en a después de la eliminación de ruido ACsN. c Obtención de imágenes por epifluorescencia de mitocondrias en una célula endotelial fija de la arteria pulmonar bovina (BPAE), tomada a una frecuencia de fotogramas de 38 Hz (tiempo de exposición: 26 ms). d La misma imagen en c después de la eliminación de ruido ACsN. imágenes con zoom e-h correspondientes a las regiones en caja en a–d, que muestran la mejora de la calidad de imagen después de la eliminación de ruido de ACsN. En particular, esta mejora es comparable a las imágenes tomadas con sensores sCMOS, como se muestra en las Figs complementarias. 5 y 6. Imágenes de i, j de calceína teñida con GFP en adipocitos vivos (lipocitos) tomadas con CMOS de bajo costo para microscopía miniaturizada antes (i) y después (j) de la eliminación de ACsN. Los datos se obtuvieron sumergiendo un miniscopio en cultivos de células vivas. k-n Imágenes ampliadas de las regiones en caja correspondientes en i y j. gráficos o, p de los perfiles de intensidad de la sección transversal de las estructuras celulares antes (gris) y después (rojo) de la eliminación de partículas ACsN a lo largo de las líneas discontinuas en k, l y m, n, respectivamente. Barras de escala: 10 µm (a, c), 4 µm (e, g), 50 µm (i), 20 µm (k).

El microscopio miniaturizado basado en excitación de fotón único, o miniscopio, se ha desarrollado para realizar imágenes de calcio de campo amplio en animales de comportamiento libre43,44,45. La miniaturización requerida se logró reemplazando las lentes de objetivos compuestos por una lente de varilla con índice de gradiente (SONRISA), que ofrece varias ventajas, incluido un bajo costo, un peso ligero y una apertura numérica relativamente alta. Estas características del miniscopio permiten obtener imágenes mínimamente invasivas de un volumen significativo del cerebro con una resolución a nivel celular durante estados complejos de comportamiento, cognitivos y emotivos46,47,48. Sin embargo, el sensor CMOS de bajo costo (MT9V032C12STM, ON Semiconductor, precio ~ ~ 15) adoptado actualmente produce una calidad de imagen pobre para obtener una velocidad de imagen relativamente alta, que puede ser severamente restrictiva para aplicaciones más amplias en imágenes celulares. Aquí, validamos la viabilidad de ACsN para el sensor de miniscopio mediante la realización de imágenes de campo amplio basadas en excitación de fotón único de calceína teñida con GFP en adipocitos vivos (Fig. 5i-p).

Microscopía de iluminación plana selectiva

A diferencia de la microscopía de campo amplio, la microscopía de iluminación plana selectiva (SPIM) ilumina la muestra con una lámina de luz perpendicular a la dirección de observación. Esto evita la iluminación innecesaria,lo que permite obtener imágenes a largo plazo sin precedentes de especímenes biológicos dinamicos49,50, 51. La microscopía de láminas de luz de celosía (LLSM) optimiza aún más el sistema óptico al iluminar la muestra con múltiples ondas planas que esculpen una celosía óptica invariante a la propagación52. Sin embargo,aunque se están investigando nuevas estrategias para abordar cuestiones relacionadas con las muestreas53, 54, el ruido de la cámara sigue siendo la limitación más importante para las capacidades de obtención de imágenes SPIM y LLSM debido a su señal de fondo relativamente baja.

Primero demostramos que la eliminación de nitrógeno ACsN puede superar esta limitación mediante la realización de una exploración volumétrica SPIM de un camarón en salmuera fija. Aquí, mejoramos la auto-similitud usando el filtrado disperso 3D a lo largo de la dirección del escaneo. Después del procesamiento de ACsN, observamos que la cancelación de ruido hace que los detalles de la muestra se destaquen mejor en cada corte individual (Fig. 7). En particular, la corrección del ruido de patrón fijo es especialmente notable en las imágenes de proyección de intensidad máxima (Fig. 6a, e y Película complementaria 5). Además, es notable observar una clara mejora en las secciones transversales ortogonales del volumen escaneado (Fig. 6b-d, f-h), lo que permite una mejor evaluación de las estructuras 3D de la muestra.

Proyecciones de intensidad máxima (MIP) de imágenes SPIM de un camarón en salmuera adulto marcado fluorescentemente antes (a) y después (e) de la eliminación de nitrógeno ACsN. Vistas ortogonales a lo largo del plano XZ de los escaneos volumétricos crudos (b–d) y desnoizados (f–h) a y = 237 mm (b, f), y = 904 mm (c, g) e y = 1491 mm (d, h). Los cortes a lo largo del plano XY y YZ se han proporcionado en la Fig.Suplementaria. 7. i Renderización tridimensional de células humanas vivas de cáncer de pulmón (NCI-H1299 NSCLC) adquirida con LLSM y procesada con eliminación de nitrógeno ACsN. Imágenes ampliadas de la zona correspondiente a la caja blanca en i antes (j) y después (k) de eliminación de ruido ACsN. La secuencia de lapso de tiempo correspondiente se ha proporcionado en las películas complementarias 6 y 7. Las imágenes MIP y los cortes representativos se representan en higos suplementarios. 9 y 10. Barras de escala: 400 µm (a, e), 100 µm (b, f), 10 µm (i), 4 µm (k).

Para validar el procesamiento de ACsN para LLSM, primero obtuvimos imágenes de células cutáneas fijas teñidas para queratina con EGFP a diferentes tiempos de exposición (5, 10 y 20 ms) utilizando una potencia de iluminación láser constante de 27 mW (medida en el plano focal posterior del objetivo de iluminación). Estas imágenes se adquirieron utilizando el modo de escaneo de muestras y, en consecuencia, los cortes tuvieron que ser desquiciados para recuperar las posiciones originales (ver Métodos). Realizamos dicha operación antes de la eliminación de ruido de ACsN para utilizar la auto-similitud a lo largo de z para el filtrado disperso en 3D. Observamos que la calidad de la imagen se puede mantener bien al eliminar el ruido incluso después de reducir cuatro veces el tiempo de exposición (Fig. 8 y Cuadro complementario 3).

Además, demostramos la restauración de imágenes ACsN de imágenes de células vivas LLSM de lapso de tiempo. En primer lugar, se tomaron imágenes de células humanas vivas de cáncer de pulmón (CPCNP NCI-H1299) en el modo de exploración de muestras con intervalos de 18,4 segundos durante más de 30 minutos (Fig. 6i-k, Suplemento Fig. 9, y Películas complementarias 6 y 7). Como se indicó anteriormente, el modo de escaneo de muestras requiere desensamblar los segmentos volumétricos, lo que aumenta el tamaño del conjunto de datos y, a continuación, la complejidad del procesamiento. Sin embargo, en contraste con el caso anterior, para las imágenes de lapso de tiempo, pudimos utilizar la auto-similitud temporal, que produce una corrección de ruido más eficiente en comparación con la volumétrica 55. Por lo tanto, eliminamos los escaneos volumétricos de lapso de tiempo procesando las pilas temporales correspondientes de cada corte individual. De esta manera, el ACsN se podría utilizar antes de desquitarse, preservando de manera efectiva el rendimiento de eliminación de ruido y ahorrando tiempo de cálculo (Fig. 10). A continuación, observamos el movimiento de F-actina endógena en fibroblastos embrionarios de ratón vivos utilizando LLSM en el modo de escaneo de hojas (ver Métodos). En particular, este modo no produce ningún cambio entre los cortes, y la información volumétrica se puede recuperar sin necesidad de encordar (Fig.Suplementaria. 11). En particular, el movimiento de filopodios alrededor de la célula se puede observar con mayor claridad después de la eliminación de partículas (Película suplementaria 8).