Einstrahl-Scanning-Spektralphotometer

Es gibt zwei Hauptklassen von Geräten: Einstrahl- und Doppelstrahl. Ein Doppelstrahlspektrofotometer vergleicht die Lichtintensität zwischen zwei Lichtwegen, wobei ein Pfad eine Referenzprobe und der andere die Testprobe enthält. Ein Einstrahl-Spektralphotometer misst die relative Lichtintensität des Strahls vor und nach dem Einsetzen einer Testprobe. Obwohl Vergleichsmessungen von Doppelstrahlinstrumenten einfacher und stabiler sind, können Einstrahlinstrumente einen größeren Dynamikbereich aufweisen und sind optisch einfacher und kompakter. Zusätzlich sind einige fachkundige Instrumente, wie Spektrofotometer, die auf Mikroskope oder Teleskope errichtet werden, Einzelstrahlinstrumente wegen der Praktikabilität.

Historisch gesehen verwenden Spektralphotometer einen Monochromator, der ein Beugungsgitter enthält, um das analytische Spektrum zu erzeugen. Das Gitter kann entweder beweglich oder fest sein. Wenn ein einzelner Detektor, wie eine Photomultiplier-Röhre oder Photodiode verwendet wird, kann das Gitter schrittweise abgetastet werden (Scanning Spectrophotometer), so dass der Detektor die Lichtintensität bei jeder Wellenlänge messen kann (was jedem „Schritt“ entspricht). Es können auch Arrays von Detektoren (Array Spectrophotometer), wie Charge Coupled Devices (CCD) oder Photodioden-Arrays (PDA) verwendet werden. In solchen Systemen ist das Gitter fixiert und die Intensität jeder Lichtwellenlänge wird von einem anderen Detektor im Array gemessen. Darüber hinaus verwenden die meisten modernen Spektralphotometer im mittleren Infrarotbereich eine Fourier-Transformationstechnik, um die spektralen Informationen zu erfassen. Diese Technik wird Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie genannt.

Bei Transmissionsmessungen vergleicht das Spektralphotometer quantitativ den Lichtanteil, der durch eine Referenzlösung und eine Testlösung fällt, vergleicht dann elektronisch die Intensitäten der beiden Signale und berechnet den Prozentsatz der Transmission der Probe im Vergleich zum Referenzstandard. Für Reflexionsmessungen vergleicht das Spektralphotometer quantitativ den Anteil des Lichts, das von den Referenz- und Testproben reflektiert wird. Licht von der Quelllampe wird durch einen Monochromator geleitet, der das Licht durch ein rotierendes Prisma in einen „Regenbogen“ von Wellenlängen beugt und schmale Bandbreiten dieses gebeugten Spektrums durch einen mechanischen Schlitz auf der Ausgangsseite des Monochromators ausgibt. Diese Bandbreiten werden durch den Prüfling übertragen. Dann wird die Photonenflussdichte (normalerweise Watt pro Quadratmeter) des transmittierten oder reflektierten Lichts mit einer Fotodiode, einem ladungsgekoppelten Gerät oder einem anderen Lichtsensor gemessen. Anschließend wird der Transmissions- bzw. Reflexionswert für jede Wellenlänge der Prüfprobe mit den Transmissions- bzw. Reflexionswerten der Referenzprobe verglichen. Die meisten Instrumente wenden eine logarithmische Funktion auf das lineare Transmissionsverhältnis an, um die Absorptionsfähigkeit der Probe zu berechnen, ein Wert, der proportional zur Konzentration der zu messenden Chemikalie ist.

Kurz gesagt, die Abfolge der Ereignisse in einem Rasterspektrophotometer ist wie folgt:

1. Die Lichtquelle wird in einen Monochromator gebeugt, in einen Regenbogen gebeugt und in zwei Strahlen aufgeteilt. Es wird dann durch die Probe und die Referenzlösungen gescannt.
2. Bruchteile der einfallenden Wellenlängen werden durch die Probe und die Referenz transmittiert oder reflektiert.
3. Das resultierende Licht trifft auf die Photodetektorvorrichtung, die die relative Intensität der beiden Strahlen vergleicht.
4. Elektronische Schaltungen wandeln die relativen Ströme in lineare Transmissionsprozentsätze und/oder Absorptions- /Konzentrationswerte um.

In einem Array-Spektralphotometer ist die Sequenz wie folgt:

1. Die Lichtquelle wird in die Probe hineingestrahlt und in einen Schlitz fokussiert
2. Das durchgelassene Licht wird mit dem Reflexionsgitter in einen Regenbogen gebrochen
3. Das resultierende Licht trifft auf die Photodetektorvorrichtung, die die Intensität des Strahls vergleicht
4. Elektronische Schaltungen wandeln die relativen Ströme in lineare Transmissionsprozentsätze und / oder Absorptions- / Konzentrationswerte um

Viele ältere Spektralphotometer müssen durch ein Verfahren kalibriert werden, das als „Nullstellen“ bekannt ist, um die nullstromausgang der beiden Strahlen am Detektor. Die Übertragung einer Referenzsubstanz wird als Basiswert (Datum) festgelegt, sodass die Übertragung aller anderen Substanzen relativ zur anfänglichen „auf Null gesetzten“ Substanz aufgezeichnet wird. Das Spektralphotometer wandelt dann das Transmissionsverhältnis in die Absorptionsfähigkeit um, die Konzentration bestimmter Komponenten der Testprobe relativ zur Ausgangssubstanz.

Anwendungen in der Biochemiebearbeiten

Spektrophotometrie ist eine wichtige Technik, die in vielen biochemischen Experimenten verwendet wird, die DNA-, RNA- und Proteinisolation, Enzymkinetik und biochemische Analysen beinhalten. Da Proben in diesen Anwendungen nicht ohne weiteres in großen Mengen verfügbar sind, eignen sie sich besonders für die Analyse in dieser zerstörungsfreien Technik. Darüber hinaus kann wertvolle Probe durch die Verwendung einer Mikrovolumenplattform eingespart werden, bei der für vollständige Analysen nur 1uL Probe benötigt wird. Eine kurze Erklärung des Verfahrens der Spektralphotometrie umfasst den Vergleich der Absorptionsfähigkeit einer Leerprobe, die keine farbige Verbindung enthält, mit einer Probe, die eine farbige Verbindung enthält. Diese Färbung kann entweder durch einen Farbstoff wie Coomasie Brilliant Blue G-250-Farbstoff, gemessen bei 595 nm, oder durch eine enzymatische Reaktion zwischen β-Galactosidase und ONPG (färbt die Probe gelb), gemessen bei 420 nm, erreicht werden.: 21-119 Das Spektralphotometer wird verwendet, um farbige Verbindungen im sichtbaren Lichtbereich (zwischen 350 nm und 800 nm) zu messen,:65 So kann es verwendet werden, um mehr Informationen über die untersuchte Substanz zu finden. In biochemischen Experimenten wird eine chemische und /oder physikalische Eigenschaft ausgewählt und das verwendete Verfahren ist spezifisch für diese Eigenschaft, um mehr Informationen über die Probe abzuleiten, wie die Menge, Reinheit, Enzymaktivität usw. Die Spektrophotometrie kann für eine Reihe von Techniken verwendet werden, z. B. zur Bestimmung der optimalen Wellenlängenabsorption von Proben, zur Bestimmung des optimalen pH-Werts für die Absorption von Proben, zur Bestimmung der Konzentrationen unbekannter Proben und zur Bestimmung der pKa verschiedener Proben.:21-119 Die Spektrophotometrie ist auch ein hilfreiches Verfahren zur Proteinreinigung und kann auch als Methode zur Erstellung optischer Assays einer Verbindung verwendet werden. Spektralphotometrische Daten können auch in Verbindung mit der Beer-Lambert−Gleichung verwendet werden, A = – log 10 ⁡ T = ϵ c l = O D {\textstyle A=-\log _{10}T=\epsilon cl=OD}

, um verschiedene Beziehungen zwischen Transmission und Konzentration zu bestimmen, und Absorption und Konzentration.:21-119 Da ein Spektralphotometer die Wellenlänge einer Verbindung durch ihre Farbe misst, kann eine farbbindende Substanz hinzugefügt werden, so dass sie eine Farbänderung erfahren und gemessen werden kann. Es ist möglich, die Konzentrationen einer Zweikomponentenmischung unter Verwendung der Absorptionsspektren der Standardlösungen jeder Komponente zu kennen. Dazu ist es notwendig, den Extinktionskoeffizienten dieser Mischung bei zwei Wellenlängen und die Extinktionskoeffizienten von Lösungen zu kennen, die die bekannten Gewichte der beiden Komponenten enthalten. Spektralphotometer wurden über Jahrzehnte entwickelt und verbessert und sind unter Chemikern weit verbreitet. Zusätzlich werden Spektrofotometer spezialisiert, um entweder UV- oder Wellenlängenabsorptionswerte des sichtbaren Lichtes zu messen.: 21-119 Es gilt als hochgenaues Instrument, das auch sehr empfindlich und daher äußerst präzise ist, insbesondere bei der Bestimmung der Farbänderung. Diese Methode ist auch für den Einsatz in Laborexperimenten geeignet, da es sich um ein kostengünstiges und relativ einfaches Verfahren handelt.