Die mobile Phase

Die mobile Phase in der Reversed-Phase-Chromatographie ist eine Mischung aus Wasser oder Puffer mit einem polaren organischen Lösungsmittel wie Methanol, Acetonitril, Isopropanol (IPA) oder Tetrahydrofuran (THF). Die Elutionsstärke nimmt in etwa in dieser Reihenfolge zu. Die Alkohole sind Protonendonatoren, während Acetonitril ein Protonenakzeptor ist. Acetonitril/Wasser-Gemische haben eine geringere Viskosität als Gemische der anderen Lösungsmittel mit Wasser. Dies führt zu einem geringeren Gegendruck. IPA/Wasser-Gemische haben die höchste Viskosität. Aufgrund des geringeren Gegendrucks, der sich aus der niedrigeren Viskosität ergibt, sind Acetonitril und Methanol die beiden am häufigsten verwendeten organischen Laufmittelmodifikatoren. Außerdem hat Acetonitril eine geringe Absorption im niedrigen UV-Bereich, viel weniger als die anderen Lösungsmittel.

Wasser ist der schwächste Eluent in der Reversed-Phase Chromatographie. Die Zugabe von Methanol oder Acetonitril vermindert die Retention. Der Logarithmus des Retentionsfaktors nimmt etwa proportional zur Konzentration des organischen Lösungsmittels ab. Wenn der Analyt ein kleines Molekül ist, wie es bei den meisten Arzneimitteln der Fall ist, nimmt die Retention etwa um das Siebenfache ab, wenn die Konzentration von Methanol in der mobilen Phase um etwa 20% ansteigt. In vielen Fällen (z.B. bei der Verfahrensentwicklung) wird angenommen, dass ein linearer Zusammenhang zwischen dem Logarithmus des Retentionsfaktors und dem Volumenanteil des organischen Modifikators in der mobilen Phase besteht. Dies sollte man jedoch nur als gute Faustregel betrachten, die weder zutreffend noch theoretisch vertretbar ist.

Aufgrund der Solvatisierungseigenschaften von Acetonitril im Vergleich zu Methanol führt der Austausch eines Lösungsmittels durch das andere häufig zu einer Änderung der Elutionsreihenfolge der Analyten (Abbildung 2). Daher wird diese Technik häufig in der Methodenentwicklung eingesetzt. Die Änderung von einem Modifikator zu einem anderen erzeugt signifikantere Selektivitätsänderungen als die Änderung der Lösungsmittelstärke allein (d. h. durch Änderung einfach der Konzentration des organischen Lösungsmittels). THF verändert auch die Selektivität drastisch. Tatsächlich werden die größten Selektivitätsänderungen häufig durch den Ersatz von Methanol oder Acetonitril durch THF verursacht. Aus mehreren Gründen, wie dem unangenehmen Geruch, der Bildung von Peroxiden und der ungünstigen UV-Transparenz, wird es jedoch nicht sehr oft verwendet.

Abbildung 2. Einfluss des Laufmittelmodifikators auf die Selektivität der Trennung. Oben Acetonitril; unten Methanol. Säule: XTerra RP18, 4,6 mm ×50 mm, 3,5 µm. Gradient bei 2 ml min-1 über 15 min von 0 bis 80% organisch bei pH 3 mit Ammoniumformiat. Analyten: 1, Triamteren; 2, Chlorthalidon; 3, Althiazid; 4, Furosemid; 5, Benzthiazid; 6, Probenecid; 7, Ethacrynsäure; 8, Bumetanid; 9, Canrensäure. (Chromatogramm zur Verfügung gestellt von Diane Diehl und Kim Tran, Waters Corporation.)

Die Interpretation der Lösungsmittelselektivität wird dadurch erschwert, dass das organische Lösungsmittel von den stationärphasigen Liganden adsorbiert wird und als Teil der stationären Phase angesehen werden kann. Kürzlich haben mehrere Autoren den Oberflächenüberschuss der organischen Modifikatoren für stationäre Standardphasen vom C18-Typ gemessen und signifikante Unterschiede in der Oberflächensolvation zwischen Acetonitril und Methanol festgestellt.

Am Anfang dieses Abschnitts wurde erwähnt, dass Methanol eine höhere Retention als Acetonitril bietet. Dies ist für ionisierte Verbindungen noch ausgeprägter als für nichtionisierte Verbindungen. Dies ist unter dem Gesichtspunkt sinnvoll, dass das adsorbierte Methanol in der stationären Phase das Eindringen der ionisierten Moleküle in die stationäre Phase erleichtert. Das gleiche Muster wird gefunden, wenn Methanol mit THF verglichen wird. Dies sind nützliche Funktionen in der Methodenentwicklung. Andererseits zeigen Verbindungen mit sulfonamidfunktionellen Gruppen im Vergleich zu einer Gruppe von Referenzanalyten eine relativ höhere Retention in THF. Insgesamt kann ein signifikanter Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Selektivität einer Trennung beobachtet werden, eine Rationalisierung ist jedoch schwierig, da sich das Lösungsmittel sowohl in der stationären- als auch in der mobilen Phase befindet. Einige Autoren haben auch versucht, mobile Phasen mit hohem Wassergehalt von solchen mit niedrigem Wassergehalt zu unterscheiden.

Wie oben erwähnt, sind die wichtigen Selektivitätsunterschiede zwischen den verschiedenen Lösungsmitteln ein sehr nützliches Werkzeug bei der Entwicklung von Umkehrphasentrennungen. Klassische Methodenentwicklungsschemata haben Methanol, Acetonitril und THF als organische Modifikatoren in der mobilen Phase verwendet. Mit Lösungsmittelgemischen können Zwischenselektivitäten erhalten werden, und eine Einstellung des Peakabstandes kann ohne Schwierigkeiten bewerkstelligt werden. Moderne Verfahrensentwicklungsschemata verwenden die Temperatur als eine weitere leicht steuerbare Variable bei der Einstellung der Selektivität.

Ein wichtiger Aspekt der Laufmittelselektivität ist der pH-Wert. Die Kontrolle der Retention ionisierbarer Verbindungen mit Hilfe von Puffern oder Säure- oder Basenadditiven an der Laufmittelphase ist sehr wichtig. Durch umsichtige Wahl des mobilen pH-Werts kann die Manipulation der Retention und Selektivität erleichtert werden. Wie oben erwähnt, kann der Unterschied in der Retention zwischen der ionisierten und der nichtionisierten Form eines Analyten das 10- bis 30-fache betragen, und die pH-Kontrolle ist wichtig.

In den letzten Jahren hat die Forschung gezeigt, dass sowohl der pH-Wert als auch die Ionisationskonstanten des Puffers verändert werden, wenn ihm organische Lösungsmittel zugesetzt werden. Dies hat wichtige Konsequenzen für die Kontrolle der Retention. Zu einer definierten Ionisierung des Analyten kann man in der Regel gelangen, wenn der pH-Wert der mobilen Phase ±2 pH-Einheiten von der pKa des Analyten entfernt ist. Wenn sich jedoch sowohl der pH-Wert als auch der Analyt-pKa durch Zugabe von organischem Lösungsmittel ändern, ist dies mit einfachen Regeln nicht einfach zu handhaben. Daher sind eine gute pH-Kontrolle und ein guter Puffer wichtige Elemente für die Reproduzierbarkeit einer Reversed-Phase-Trennung ionisierbarer Analyten. Der pH-Wert wird in Wasser gemessen, wo man mit den pKa-Werten der üblicherweise verwendeten Puffer vertraut ist und man bevorzugt in der Nähe dieser pKa-Werte bleibt. Die maximale Pufferkapazität wird am pKa des Puffers gefunden. Während sich der pH-Wert in Gegenwart des organischen Lösungsmittels ändert, ändert sich die Pufferkapazität nicht. Für den Praktiker der Umkehrphasenchromatographie ist dies ein wichtiger Aspekt der Retentionskontrolle. Auf der anderen Seite muss der Forscher von Reversed-Phase-Retentionsmechanismen bereit sein, den pH-Wert in Gegenwart des organischen Lösungsmittels zu messen, um seinen Einfluss auf die Retention vollständig zu verstehen. Typischerweise führt die Zugabe des organischen Lösungsmittels zu einer Erhöhung der pKa von Säuren und zu einer Abnahme der pKa für Basen. Dies gilt sowohl für die Puffer als auch für die Analyten. Dies kann zu einer signifikanten Verschiebung des erwarteten Ionisationsmusters eines Analyten führen. Hier ist ein Beispiel, das dies veranschaulicht: ein Amin mit einem pKa von 9 wird in einem Phosphatpuffer bei pH 7 in Wasser vollständig ionisiert, kann aber nach Zugabe von 70% Methanol im gleichen Puffer nur halb ionisiert werden. Es ist klar, dass solche Effekte signifikant sind. Daher ist eine genaue Methode zur Herstellung eines Puffers und zur Kontrolle seines pH-Werts für eine gute Kontrolle der Reversed-Phase-Retention ionisierbarer Analyten von entscheidender Bedeutung.

Andere ionische Wechselwirkungen beeinflussen auch die Retention und die Selektivität einer Reversed-Phase-Trennung ionisierter Analyten. Ein klassisches Werkzeug zur Erhöhung der Retention ionischer Analyten ist die Ionenpaarchromatographie. Bei dieser Technik wird die stationäre Phase mit einem hydrophoben geladenen Ion, wie einem langkettigen Sulfonsäureion (z. B. Octylsulfonat) oder einem hydrophoben quaternären Amin (z. B. dem Tetrabutylammoniumion), äquilibriert. Eine typische mobile Phasenkonzentration beträgt etwa 10 mm. Die Zugabe des Ionenpaarreagenzes zur mobilen Phase erhöht die Retention von Zielionen, verringert die Retention von Ionen derselben Ladung wie das Ionenpaarreagenz und lässt die Retention neutraler Analyten einschließlich Zwitterionen nahezu unberührt. Somit ist es ein hervorragendes Werkzeug, um die Selektivität einer Trennung einzustellen. Der Grund für diese Änderungen der Selektivität ist die Tatsache, dass das Ionenpaarreagenz an der Oberfläche der stationären Phase adsorbiert wird. Die einfachste Interpretation des resultierenden Retentionsmechanismus ist eine Kombination von Ionenaustausch mit dem Umkehrphasenmechanismus. Mit zunehmender Konzentration des Ionenpaarreagenzes in der mobilen Phase nimmt die Retention entgegengesetzt geladener Analyten zunächst zu und nivelliert sich dann bei höheren Konzentrationen ab. Bei Ionenpaarreagenzien mit unterschiedlicher Kettenlänge steigt die Retention bei längerer Kettenlänge schneller an.Ein weiterer Ioneninteraktionseffekt, der bei kationischen Analyten auftritt, ist die Erhöhung der Retention, wenn der mobilen Phase kleine anorganische Gegenionen zugesetzt werden. Die erforderlichen Konzentrationen sind typischerweise etwa 10-fach höher als die Konzentrationen, die mit Ionenpaarreagenzien verwendet werden. Typische Anionen dieses Typs sind Perchlorat (ClO4−), Tetrafluorborat (BF4−) oder Hexafluorphosphat (PF6−). Sie erhöhen die Retention von kationischen Analyten signifikant. Der Effekt ist mit Acetonitril als Laufmitteladditiv ausgeprägter als mit Methanol. Dies erklärt sich durch eine dickere Schicht aus Acetonitril, die an der stationären Phase adsorbiert ist, als eine monomolekulare Schicht aus Methanol, und die Aufteilung des Gegenions in diese Schicht. Aus Anwendersicht ist das Retentionsverhalten kationischer Analyten in Gegenwart dieser anorganischen Anionen nicht unähnlich demjenigen, das mit echten Ionenpaarreagenzien, d.h. mit langkettigen Sulfonsäuren, beobachtet wird.