Pflanzenmaterial

Beobachtungen und chemische Analysen wurden von 2011 bis 2018 an einer Sammlung von Pflanzen durchgeführt, die im Versuchsgarten des Campus der Universität Louvain-la-Neuve (50 ° 39’55″N; 4°37’11“ E). Vor und während der Blütezeit (Juli–August) wurden die Pflanzen in den Wachstumskammern der Universität unter kontrollierten Bedingungen (24/22 °C; 16 L:8D, RH 80 ± 10%) platziert.

Insektenmaterial

Die wichtigsten Insektenbesucherarten von A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum und B. terrestris) wurden in Versuchen zur Blütenattraktivität und Geschmackspräferenz verwendet. A. mellifera- und B. pascuorum-Individuen (10 pro Test und Behandlung) wurden am Morgen vor den Tests in freier Wildbahn auf dem Universitätscampus (mindestens vier Standorte pro Art) gesammelt. Als B. wir haben Hummeln aus vier Bienenstöcken (Biobest, Westerloo, Belgien) in der Nähe der Universitätsgebäude verwendet, um Individuen für Experimente zu erhalten.

Blütenmerkmale

Pollenzahl

Die Staubbeutel von 10 Blüten in männlicher und weiblicher Phase wurden gesammelt, gezählt, getrocknet und auf ein Sieb (90 µm) gelegt, um gerieben zu werden, um Pollenkörner zu sammeln. Die Menge der Pollenkörner wurde gewogen. Pollenzählungen wurden an der Universität Lille-1 (Evo-Eco-Paleo Unit) durchgeführt. Wir verwendeten einen Partikelzähler, um die Anzahl der Pollenkörner in diesen Proben abzuschätzen. Am Tag vor der Pollenzählung wurden die Proben in eine Röhrenheizung gegeben, bis der größte Teil des Ethanols verdunstet war. Anschließend erzwangen wir die Antheren-Dehiszenz, indem wir die Proben über Nacht bei 56 ° C in einen Ofen stellten. Wir fügten jeder Pollenprobe 1 ml destilliertes Wasser hinzu. Die Röhrchen wurden dann beschallt und vortexiert, um Pollenkörner von den Antheren und voneinander zu trennen. Die Pollenlösung (200 µL) wurde anschließend in 5 ml isotonischem Messpuffer (CASY® ton) verdünnt. Der Partikelzähler analysierte drei 400-µL-Proben aus der Pollensuspension und lieferte die Gesamtpartikelzahl in diesem 1200-µL-Volumen sowie Zählungen für 400-Größenklassen von 0.125 bis 150 µm. Vergleiche mit Blindproben ermöglichten es uns, Peaks von Partikeln mit einer Größe von 20 bis 30 µm zu identifizieren, was Pollenkörnern entspricht. Die Anzahl der Pollenkörner pro Staubbeutel wurde geschätzt, indem die vom Partikelzähler gelieferten Werte mit dem Verdünnungsverhältnis (d.h. (1000/200) × (5000 + 200)/1200).

Blütenfarbe und Morphologie

Wir haben Blütenmerkmale (Blütenkronenlänge, Blütenkronendurchmesser, Blütenfarbe und UV-Reflexion) an 10 Blüten pro Phase (von 10 verschiedenen Individuen) gemessen. Helmbreite, Helmlänge und Durchmesser wurden mit einem Messschieber gemessen. Wir haben das Tepal-Farbreflexionsspektrum mit einem faseroptischen Spektrometer (Avaspec-ULS2048) und einer Xenon-gepulsten Lichtquelle (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Niederlande) gemessen. Für UV-Reflexionsmessungen wurden Blumen auf schwarzem Grund fixiert und mit einer Nikon D40 (Coastal Optical 60 mm 1) fotografiert:4 UV-VIS-IR ApoMakro; Filter X-Nite 330).

Floral volatile collection

Wir haben flüchtige organische Verbindungen (VOCs) aus intakten Blüten der männlichen und weiblichen Phase entnommen (N = 4 für jede Phase). Jede Blume wurde einzeln in einen Glaskolben (50 mm Länge und 30 mm Durchmesser) mit einer Öffnung von 17 mm Durchmesser eingesetzt. Um eine Luftkontamination zu vermeiden, wurde ein mit Aktivkohle gefülltes Teflonrohr mit einem Ende des Glaskolbens und zwei Tenax TA-Glasrohre (6 mm × 4 mm, 7 Zoll; 60-80 Mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgien) mit dem anderen Ende verbunden. Die Tenax-Röhrchen wurden an kalibrierte Luftpumpen (Gilair plus, Sensidyn, St. Petersburg, USA) mit einer Durchflussrate von 50 ml· min−1 für 180 min (zwischen 11:00 und 14:00 h) angeschlossen. Die Laborbedingungen lagen zwischen 21,5 und 23,5 °C mit 45 bis 55% RF.

Eingeschlossene VOCs wurden anschließend auf einem Gaschromatographen Agilent 6800 thermisch desorbiert, der mit einer Gerstel TDU−Thermodesorptionseinheit und einem CIS-Kryokühler ausgestattet war, der auf -50 ° C gehalten wurde. Unmittelbar nach der Thermodesorption wurde die CIS-Einheit T ° bei 12 ° C sec-1 von -50 ° C auf 300 ° C programmiert. Die GLC-Apparatur wurde an ein Massenspektrometer Agilent 7975 C gekoppelt. Analytische Bedingungen waren wie folgt: Split-Mode-Injektion (mit Split−Verhältnis von 50:1, Helium bei 1,6 ml min-1 als Trägergas), VF-Max MS 30 m x 250 µm (df = 0,25 µm) Säule (Agilent). Das Temperaturprogramm, das die beste Trennung ermöglicht (Vorversuche nicht dargestellt), wurde wie folgt festgelegt: 40 °C (5 min), dann auf 75 °C bei 4 °C min−1 und auf 115 °C (3 °C min−1) und schließlich auf 250 °C bei 13 °C min−1. Die Bedingungen waren wie folgt: EI-Modus bei 70 eV, Quelle T ° = 250 ° C, MS-Quadrupol bei 200 ° C und gescannter Massenbereich 35 bis 500 amu.

Die aufgezeichneten Chromatogramme wurden systematisch interpretiert, um nach VOCs zu suchen, die für männliche oder weibliche Phasen spezifisch sind. Bei der Detektion wurden die Moleküle nach berechneten Datenbanken identifiziert (Wiley 250.L und PAL 600). Die Identifikationen wurden basierend auf den Retentionsdaten von reinen Molekülen im Handel bestätigt. Sie wurden auch bezogen auf hochreinen internen Standard quantifiziert (Limonen, 1 µL Methanollösung bei 0.67 µg µL1 vor dem thermischen Prozess automatisch in jedes Desorptionsröhrchen gegeben).

Umgebungsluft wurde auch als Kontrolle gesammelt, um Hintergrundkontaminanten zu identifizieren. Um einen möglichen Durchbruch zu verhindern, wurde eine zweite Glaspatrone, die mit demselben Adsorbens (Tenax TA) beladen war, systematisch in Tandem gelegt. Die Analyse ergab keine Spuren der interessierenden Moleküle.

Alkaloidsammlung und Analysen

Antheren wurden von 50 Blüten (von 10 Individuen) gesammelt, getrocknet und dann auf einem Sieb (90 µm) zerkleinert, um Pollenkörner zu sammeln. Drei Replikate von 15 mg Pollen wurden auf Alkaloide untersucht. Die Proben wurden 2 h eingefroren (-80°C) und anschließend gefriergetrocknet. Trockene Proben wurden mit flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver vermahlen und eingewogene Pulvermengen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) gegeben. Alkaloide wurden mit einem Gewebehomogenisator (VWR-Ultraschallreiniger) für 10 min in 100 µL Extraktionspuffer (70% wässriges Methanol und 0,5% Ameisensäure) extrahiert. Nach 5 min Zentrifugation bei 12.000 upm (Zentrifuge 5430 R) wurde der Überstand in ein 1,5ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Nach dem Trocknen im SpeedVac wurden Alkaloide in 200 µL LC-MS-grade Methanol resuspendiert und mit einem 0,45µm PTFE Spritzenfilter (Whatman) filtriert.

Nektar wurde in 5 µL Glaskapillarröhrchen (Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Deutschland) von 50 Blüten (von 10 Individuen) gesammelt. Drei Replikate von 15 µL Nektar wurden in einem SpeedVac getrocknet und vor der Filtration mit einem 0,45 µm PTFE-Spritzenfilter (Whatman) in 200 µL LC-MS-Methanol resuspendiert.

Chemische Analysen wurden mit einem LC-MS/MS-System durchgeführt, das aus einer Thermo Accela-Pumpe, einem Autosampler, einem Photodioden-Array-Detektor und einem Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL-Massendetektor (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Woluwe, Belgien) bestand. Es wurde eine Phenomenex Gemini C18 Säule verwendet (2 mm × 150 mm, gepackt mit 3 µm Partikeln). Es wurde ein binäres Lösungsmittelsystem mit einer Flussrate von 300 µL min−1 verwendet: Lösungsmittel A, HPLC-Wasser (0,1% Ameisensäure); und Lösungsmittel B, LC-MS-Methanol (0 min: 95% A, 10-12 min: 0% A, 13-17 min: 95% A). Es wurde ein Volumen von 10 µL injiziert und die Säulentemperatur auf 30 °C eingestellt. Die hochauflösende MS wurde mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle im positiven Modus durchgeführt. Die folgenden Einlassbedingungen wurden angewendet: Kapillartemperatur, 275 °C; Kapillarspannung, 13 V; Tubuslinse, 140 V; Mantelgasstrom, 30 a.u.; und Hilfsgasstrom, 10 u.a. Datenerfassung und -verarbeitung wurden mit der Xcalibur-Software durchgeführt. Diese Methode deckte den Massenbereich aller Alkaloide ab (MW von 329 bis 673). Alkaloide aus Pollen und Nektar wurden durch hochauflösende MS nachgewiesen und vorläufig identifiziert. Die durch kollisionsinduzierte Dissoziation erhaltene Fragmentierung half bei der Identifizierung. Alkaloidkonzentrationen wurden basierend auf einer Aconitin-Standardkurve in MeOH berechnet und als „Aconitin-Äquivalent“ ausgedrückt. Die analysierten Alkaloide wurden auf der Grundlage ihrer Anwesenheit in anderen Aconitum-Arten ausgewählt4,8.

Nektarproduktion und Zuckerzusammensetzung

Nektar wurde in 5-µL-Glaskapillarröhrchen (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Deutschland) von Blüten der Pflanzen gesammelt, die in die Wachstumskammern auf dem Universitätscampus transferiert wurden (keine Insektenbesuche). Wir schätzten den Nektarproduktionstrend während des Tages zu Beginn der Anthese, indem wir 2 Blüten von 12 Individuen alle 2 Stunden während 10 Stunden probierten. Wir haben auch die gesamte Nektarproduktion pro Blüte (2 Blüten von 12 Individuen) für die gleichen Blüten alle 2 Tage während der gesamten (9 Tage) Blütenlebensspanne gemessen, jeden Tag zur gleichen Zeit, 2 Stunden nach dem Einschalten des Lichts. Die Gesamtproduktion für die männliche und weibliche Phase wurde anhand der Probenahme am Ende der männlichen (5 Tage nach der Anthese) und weiblichen (8 Tage) Phase geschätzt.

Nektarproben wurden bei -80 °C gelagert, bis chemische Analysen durchgeführt wurden. Nach der Ableitung erfolgte die Identifizierung und Quantifizierung des Zuckers mittels GC-MS (Thermo Trace 1310 /Thermo ISQ-QD). Es wurde eine Restek Rxi-5Sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 µm df) Säule verwendet. Die Flussrate betrug 1,0 ml min-1 (Helium). Die injizierten Spaltverhältnisse betrugen 1/10 für die Hexosen und 1/100 für Saccharose. Die folgenden Einlassbedingungen wurden angewendet: Ofentemperatur, 105 ° C für 4 min, dann auf 280 ° C bei 15 ° C min-1 (für 20 min) und Injektortemperatur von 250 °C.Der Gesamtzuckergehalt des Nektars pro Blüte (mg) wurde dann berechnet als Nektarvolumen (µl) x Gesamtzuckerkonzentration (mg/µl).

Insektenverhalten

In den Jahren 2011 und 2012 fanden Untersuchungen an den vier verbliebenen natürlichen Populationen in Mooren in Südbelgien statt. Von diesen beherbergt das Naturschutzgebiet „Les Abattis“ (49 ° 40’50″N; 5 ° 32’59″E) die größte und dichteste Population (2970 m2 mit 1330 ± 1030 A. napellus flowers m−2). Bei „Fouches“ (49 ° 4’8″N; 5 ° 43’06″E), der zweitgrößten Population (1788 m2), Individuen von A. napellus waren sehr verstreut über das Gebiet und bei viel niedrigeren Dichten (176 ± 177 Blüten m-2) „Chantemelle“ (49 ° 39’37″N; 5 ° 39’37″E)“ hatte eine diskontinuierliche Population bestehend aus drei Flecken (161, 423 und 500 m2) mit relativ niedrigen Pflanzen− und Blütendichten (179 ± 125 Blüten m-2). „Sainte-Marie“ (49 ° 40’06″N; 5 ° 32’56″E) hatte eine winzige und lückenhafte Bevölkerung (292 m2, 152 ± 163 ± m−2), die sich etwa 150 m entlang einer ehemaligen Eisenbahnstrecke erstreckte.

Blütenbesucher wurden in 10-minütigen Beobachtungen während der Spitzenblüte an drei aufeinanderfolgenden Tagen im Jahr 2011 (zwischen dem 30. August und dem 3. September) und an vier Tagen im Jahr 2012 (zwischen dem 21. und 27. August) bei trockenen und warmen Wetterbedingungen aufgezeichnet. Der Anteil männlicher Phasenblüten war an diesen Tagen und in allen Populationen höher als bei weiblichen Phasenblüten (etwa 85%). Blüten innerhalb von 1 m2 (oder etwa fünf Pflanzen) wurden gleichzeitig beobachtet. Es wurden mindestens zehn Beobachtungen pro Population durchgeführt (maximal 16), verteilt auf die gesamten Populationen und über verschiedene Tageszeiten. Für jeden Besucher haben wir die Arten, die Anzahl der geraubten und nicht geraubten Blumen, die pro Pflanze und Stück besucht wurden, die Zeit, die pro einzelne Blume aufgewendet wurde, sowie ihr Nahrungssuchverhalten (Pollen- oder Nektarsammlung, legitimer oder illegitimer Besuch, als Raub bezeichnet) erfasst (Basisarbeit, primärer und sekundärer Raub). Während 530 Minuten Blütenbeobachtungen im Jahr 2011 und 400 Minuten im Jahr 2012 verzeichneten wir 183 Blütenbesucher. Hummeln (B. pascuorum und B. hortorum) und Honigbienen (Apis mellifera) waren die wichtigsten Blütenbesucher; Nur 3 B. terrestris-Individuen wurden beobachtet.

Pollentragfähigkeit

Dreißig Individuen pro Spezies wurden mit Ethylacetat getötet und einzeln bestückt. Pollen wurde von den verschiedenen Insektenkörperteilen mit kleinen Würfeln Gelatine-Glycerin entfernt53. In den Corbicula konzentrierte Pollenkörner wurden entfernt und nicht in die Analysen einbezogen. Alle Pollenkörner wurden lichtmikroskopisch gezählt.

Reinheit der Pollensammlung

Wir haben Pollenbelastungen von Hummeln untersucht, die A. napellus in den natürlichen Populationen besuchten. Im Labor wurden Pollenbelastungen acetolysiert53. Mindestens 400 zufällig ausgewählte Pollenkörner jeder der 25 Pollenlasten wurden identifiziert und unter Lichtmikroskopie gezählt.

Geschmacksreaktionen von Insektenbesuchern

Wir folgten dem Protokoll von Ma et al.54 für aconitin Erkennung. Nach dem Fang wurden einzelne Bienen 3 Stunden lang in einem Plastikfläschchen (7 cm lang, 2,8 cm Innendurchmesser) bei Raumtemperatur und in völliger Dunkelheit im Labor ausgehungert. Wir übertrugen jede Biene in ein Halteröhrchen, ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit einem 4-mm-Loch an der Spitze und einem darin befestigten Stück Stahlgitter. Nach einer Vortestphase mit einem Tropfen Saccharose präsentierten wir die Testlösung in einem 100-µL-Glaskapillarröhrchen und drückten den Schlauch vorsichtig zusammen, um die Lösung an der Spitze des Röhrchens zu halten. Jedes Insekt ohne Rüsselverlängerung nach 5 Minuten wurde aus dem Test entfernt. Die Testphasen waren 2 Minuten lang, und das Volumen der Lösung vor und nach dem Test wurde mit einem Taster aufgezeichnet.

Tests wurden mit drei Besucherarten (A. mellifera, B. pascuorum und B. terrestris) durchgeführt. Zehn Individuen pro Insektenart wurden mit jeder Lösung getestet. Die Konzentrationen von Saccharose (430 µg mg−1) und Aconitin (232 µg g−1) entsprachen denen unserer Spezies. Es wurden drei Lösungen vorgestellt: entionisiertes Wasser allein (Kontrolle), reine Saccharoselösung und Saccharose plus Aconitinlösung.

Für alle Tests wurde für jedes Subjekt ein Abschreckungsindex aus der Wahl des Getränks, dem Volumen der verbrauchten Lösung und der Zeit des Kontakts mit der Lösung wie folgt berechnet: ID = 1- (Wahl für Saccharose / Wahl für Saccharose + Aconitin) × (verbrauchtes Volumen an Saccharose / verbrauchtes Volumen an Saccharose + Aconitin) × (Zeit des Kontakts mit Saccharoselösung / Zeit des Kontakts mit Saccharose + Aconitinlösung).

Statistische Analysen

Die Normalität der Daten wurde mit Shapiro–Wilk-Tests geschätzt, und die Homoskedastizität wurde mit Levenes Tests verifiziert. Wenn Normalitäts- und Homoskedastizitätsanforderungen erfüllt waren, wurden Varianzanalysen (ANOVAs) durchgeführt (Blütenphaseneffekt auf blütenflüchtige Stoffe). Ansonsten wurden nichtparametrische Tests unter Verwendung des Wilcoxon-Tests zum Vergleich von zwei Bedingungen (Blütenphaseneffekt auf Blütenmorphologie und Nektarparameter) und des Kruskall-Wallis-Tests zum Vergleich von mehr als zwei Bedingungen (Insekten- und Lösungseffekt) durchgeführt verbrauchtes Volumen und Kontaktdauer mit der Lösung in Geschmacksexperimenten, Insekteneffekt auf das Besuchsverhalten) und Chi-Quadrat-Tests wurden durchgeführt, um die Prozentsätze von Individuen in Geschmacksexperimenten zu vergleichen. Auf ANOVA- und nichtparametrische Analysen folgte ein mehrpaariger Vergleich, wenn mehr als zwei Bedingungen verglichen wurden. Alle Analysen wurden im SAS Enterprise Guide 7.1 durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichungen dargestellt.