Durchführung der HPLC

Einführung

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist im Grunde eine stark verbesserte Form der Säulenchromatographie. Anstatt ein Lösungsmittel unter Schwerkraft durch eine Säule tropfen zu lassen, wird es unter hohen Drücken von bis zu 400 Atmosphären hindurchgedrückt. Das macht es viel schneller.

Außerdem können Sie eine sehr viel kleinere Partikelgröße für das Säulenpackungsmaterial verwenden, wodurch eine viel größere Oberfläche für Wechselwirkungen zwischen der stationären Phase und den daran vorbeiströmenden Molekülen entsteht. Dies ermöglicht eine viel bessere Trennung der Komponenten der Mischung.

Die andere wesentliche Verbesserung gegenüber der Säulenchromatographie betrifft die Nachweismethoden, die verwendet werden können. Diese Methoden sind hoch automatisiert und äußerst sensibel.

Die Säule und das Lösungsmittel

Verwirrenderweise werden in der HPLC zwei Varianten verwendet, die von der relativen Polarität des Lösungsmittels und der stationären Phase abhängen.

Normalphasen-HPLC

Dies ist im Wesentlichen genau das gleiche, was Sie bereits in der Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie gelesen haben. Obwohl es als „normal“ beschrieben wird, ist es nicht die am häufigsten verwendete Form der HPLC.

Die Säule ist mit winzigen Kieselsäurepartikeln gefüllt, und das Lösungsmittel ist unpolar – beispielsweise Hexan. Eine typische Säule hat einen Innendurchmesser von 4,6 mm (und kann kleiner sein) und eine Länge von 150 bis 250 mm.

Polare Verbindungen in der Mischung, die durch die Säule geleitet wird, haften länger an der polaren Kieselsäure als unpolare Verbindungen. Die unpolaren passieren daher schneller die Säule.

Reversed Phase HPLC

In diesem Fall ist die Säulengröße gleich, aber die Kieselsäure wird modifiziert, um sie unpolar zu machen, indem lange Kohlenwasserstoffketten an ihre Oberfläche gebunden werden – typischerweise mit entweder 8 oder 18 Kohlenstoffatomen in ihnen. Ein polares Lösungsmittel wird verwendet – beispielsweise eine Mischung aus Wasser und einem Alkohol wie Methanol.

In diesem Fall besteht eine starke Anziehung zwischen dem polaren Lösungsmittel und polaren Molekülen in der Mischung, die durch die Säule geleitet wird. Es wird nicht so viel Anziehungskraft zwischen den Kohlenwasserstoffketten, die an die Kieselsäure (die stationäre Phase) gebunden sind, und den polaren Molekülen in der Lösung geben. Polare Moleküle in der Mischung verbringen daher die meiste Zeit damit, sich mit dem Lösungsmittel zu bewegen.

Unpolare Verbindungen in der Mischung neigen aufgrund der van-der-Waals-Dispersionskräfte dazu, Attraktionen mit den Kohlenwasserstoffgruppen zu bilden. Sie sind auch im Lösungsmittel weniger löslich, da beispielsweise Wasserstoffbrückenbindungen aufgebrochen werden müssen, wenn sie sich zwischen die Wasser- oder Methanolmoleküle quetschen. Sie verbringen daher weniger Zeit in Lösung im Lösungsmittel und dies verlangsamt sie auf ihrem Weg durch die Säule.

Das bedeutet, dass jetzt die polaren Moleküle schneller durch die Säule wandern.

Reversed Phase HPLC ist die am häufigsten verwendete Form der HPLC.