GDF11PRO-Fc bindet sowohl an GDF11 als auch an MSTN

Um zu zeigen, dass GDF11PRO-Fc aktives reifes GDF11-Dimer Über eine direkte Interaktion wollten wir eine Protein-Protein-Interaktion zwischen GDF11 und GDF11PRO-Fc identifizieren. Aufgrund der engen strukturellen Homologie der reifen GDF11- und MSTN-Dimere wollten wir außerdem bestimmen, ob GDF11PRO-Fc mit MSTN assoziiert ist. Um diese Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren, führten wir eine Reihe von Pull-Down-Assays durch (Abb. 1). Die Liganden rGDF11, rMSTN und rActivin A wurden mit Lysatfraktionen aus HEK293-Zellen inkubiert, die mit einem für GDF11PRO-Fc oder MPRO-Fc kodierenden Plasmid bei pH 7,4 transfiziert waren. Aufgrund der konjugierten Fc-Fragmente auf den modifizierten Propeptiden konnten Fraktionen direkt auf ein Protein-A/G-Agaroseharz heruntergezogen werden. Wie erwartet zog GDF11PRO-Fc sowohl rGDF11 als auch rMSTN effektiv herunter, was darauf hinweist, dass GDF11PRO-Fc in der Lage war, beide Liganden zu binden. Darüber hinaus hat MPRO-Fc sowohl rGDF11 als auch rMSTN erfolgreich heruntergezogen. Sowohl GDF11PRO-Fc als auch MPRO-Fc waren nicht in der Lage, den entfernteren verwandten TGF-β-Superfamilienligand rActivin A herunterzuziehen, was darauf hinweist, dass die Ligandenbindung spezifisch ist (Abb. 1). An einem Kontrollagaroseharz ohne Protein A/G wurde keine Bindung von GDF11PRO-Fc, MPRO-Fc, rGDF11, rMSTN oder rActivin A beobachtet. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass GDF11PRO-Fc bei physiologischem pH-Wert spontan mit den reifen GDF11- und MSTN-Dimeren assoziiert ist.

GDF11PRO-Fc verbindet sich mit GDF11 und MSTN. Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen GDF11PRO-Fc oder MPRO-Fc und rGDF11, rMSTN oder rActivin A wurden durch einen Pull-Down-Assay bestimmt. GDF11PRO-Fc oder MPRO-Fc wurde mit rGDF11, rMSTN oder rActivin A für 1 h bei 4°C inkubiert. Fc-fusionierte Proteinkomplexe wurden auf einem Protein A/G-beschichteten Agaroseharz aufgetrennt und Eluate auf einem 12%igen SDS-PAGE-Gel unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt und mittels Western Blot untersucht. Die Eingangskontrolle betrug 5% des Eingangsmaterials. WB Western Blot

GDF11PRO-Fc blockiert GDF11 / MSTN-induzierte Atrophie in C2C12-Myotubes

Es wurde bereits gezeigt, dass die Zugabe von rGDF11 und rMSTN zu differenzierten Myotubes eine Atrophie in murinen C2C12- und primären menschlichen Skelettmyotubes induziert . Nachdem wir festgestellt hatten, dass GDF11PRO-Fc GDF11 und MSTN bindet, fragten wir als nächstes, ob GDF11PRO-Fc eine GDF11 / MSTN-induzierte Myotubusatrophie in differenzierten C2C12-Myotubes verhindern könnte. Um dies zu erreichen, haben wir die DNA-Sequenz, die für GDF11PRO-Fc kodiert, in das AAV6-Kapsid gepackt, um den AAV6-GDF11PRO-Fc-Vektor zu erzeugen. In diesen Experimenten wurde der AAV6-Vektor aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, differenzierte C2C12-Myotuben effizient und selektiv zu transduzieren, nicht jedoch Myoblasten . C2C12-Myoblasten wurden 5 Tage vor der Behandlung mit AAV6-GDF11PRO-Fc oder AAV6-EGFP (Kontrollvektor) bei einem MOI von 105 kultiviert und differenziert (Abb. 2a). Wie erwartet war die GFP-Expression in C2C12-Myotuben, die mit AAV6-EGFP infiziert waren, 48-72 h nach der Infektion beobachtbar, und die Quantifizierung internalisierter Vektorgenomkopien pro diploidem Genom 72 h nach der Infektion zeigte, dass die Vektortransduktion ausreichend erreicht wurde (Abb. 2b und c).

GDF11PRO-Fc blockiert die GDF11/MSTN-induzierte Myotubusatrophie in C2C12-Zellen. eine schematische Detaillierung experimentelle Timeline in C2C12 myotubes. AAV6-EGFP oder AAV6-GDF11PRO-Fc wurde zu C2C12-Myotubes mit einem MOI von 105 am Tag 5 nach der Differenzierung und 100 ng / ml rGDF11 oder rMSTN am Tag 7 hinzugefügt. Myotubes wurden gefärbt und am Tag 10 analysiert. die b-EGFP-Expression war bei 48-72 h in C2C12-Myotuben, die mit AAV6-EGFP (MOI 10) behandelt wurden, offensichtlich. Skalenbalken stellen 50 µm dar. c-Vektor-Genom-Kopienzahl pro diploidem Genom in C2C12-Myotubes 72 h nach Zugabe von AAV6-EGFP oder AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10). d Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von C2C12-Myotuben. C2C12-Myotubus-Membranen wurden durch Färbung mit einem Anti-Dystrophin-Antikörper (rot) sichtbar gemacht. Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Inset zeigt einen gezoomten Bereich. Skalenbalken repräsentieren 50 µm (Hauptpanel) und 25 µm (Panel Inset). e Der Anteil der in Myotuben eingebauten Kerne (Differenzierungsindex) wurde berechnet und als Prozentsatz der Kontrolle dargestellt. f Durchschnittlicher Myotubusdurchmesser relativ zur Kontrolle und (g) Verteilung der Durchmessermessungen. Für Messungen des Myotubusdurchmessers wurde jedes Myotubus an drei Punkten entlang der Länge des Myotubus gemessen und gemittelt. h Anzahl der Kerne pro Myotube eingebaut. Pro Versuchszustand wurden mindestens 50 Myotuben analysiert. i pSMAD2/3 relativ zu tSMAD2/3 wurde durch Western Blot bewertet. Die gleiche Proteinbeladung wurde durch Ponceau S-Färbung verifiziert und GAPDH wurde als Beladungskontrolle verwendet. Die Daten stellen Ergebnisse aus drei separaten Experimenten dar. Alle Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Zweiundsiebzig Stunden später wurden Myotubes fixiert und für die Immunfluoreszenzanalyse mit einem Dystrophin erkennenden Antikörper (Stab 22 / Stab 23) gefärbt, um periphere Membranen von Myotubes und DAPI zur Färbung von Myonuclei sichtbar zu machen (Abb. 2d). Bei mit rGDF11 (− 15%, p = 0, 0008) oder rMSTN (− 14%, p = 0, 0013) behandelten Myotuben wurde im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle eine Verringerung des Differenzierungsindex beobachtet, der als Anteil der in Myotuben eingebauten Myonuclei definiert ist. Dieser Effekt wurde jedoch in GDF11PRO-Fc-exprimierenden C2C12−Myotubes, die mit rGDF11 behandelt wurden, abgestumpft (- 1,9%; p = 0.0047, verglichen mit rGDF11-behandelter Kontrolle) oder rMSTN (− 3,0%; p = 0,0040, verglichen mit rMSTN-behandelter Kontrolle; Abb. 2e). Darüber hinaus widerstanden C2C12-Myotuben, die mit AAV6-GDF11PRO-Fc behandelt wurden, einer rGDF11- oder rMSTN-induzierten Myotubusatrophie. Bei mit rGDF11 (− 39%; 0,0002) oder rMSTN (− 35%; p = 0,0003) behandelten Myotubes wurde im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Abnahme des durchschnittlichen Myotubusdurchmessers im Vergleich zur Kontrolle festgestellt. Im Gegenteil, Myotuben, die GDF11PRO-Fc exprimieren, wurden mit rGDF11 (− 1, 8%; p = 0, 0005 im Vergleich zur rGDF11-behandelten Kontrolle) oder rMSTN (− 5, 3%; p = 0) behandelt.0075 im Vergleich zur rMSTN-behandelten Kontrolle) weitgehend unbeeinflusst (Abb. 2f und g). In einem separaten Experiment konnte GDF11PRO-Fc eine rActivin A-induzierte Myotubusatrophie nicht verhindern, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass GDF11PRO-Fc Activin A nicht bindet (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S3).

Die Behandlung mit rGDF11 oder rMSTN war auch mit einem geringeren Anteil reifer Myotuben mit einer höheren Anzahl von Myonkernen verbunden, was auf eine Hemmung der Myotubusdifferenzierung hindeutet. Myotubes mit mehr als 11 myonuclei umfassten nur 5,2% (p = 0,0215) und 7,2% (p = 0.0328) von myotubes analysiert in den Zellen, die mit rGDF11 und rMSTN beziehungsweise behandelt werden. Im Vergleich dazu machten Myotubes mit mehr als 11 Kernen 26% der in Kontroll-Myotubes analysierten Myotubes aus. In GDF11PRO-Fc exprimierenden Myotubes, die mit rGDF11 oder rMSTN behandelt wurden, betrug der Anteil an Myotubes mit mehr als 11 Myonuclei 22% (p = 0,0104 im Vergleich zur rGDF11-behandelten Kontrolle) bzw. 19% (p = 0,0404 im Vergleich zur rMSTN-behandelten Kontrolle) (Abb. 2h). Schließlich war in Übereinstimmung mit dem, was nach der GDF11 / MSTN-Signalisierung bei ActRII zu erwarten wäre, ein Anstieg der phosphorylierten SMAD2 / 3 (pSMAD2 / 3) -Proteinspiegel in Myotuben, die mit AAV6-EGFP und rGDF11 oder rMSTN behandelt wurden, auf Western Blot 24 h nach Zugabe von Liganden zu beobachten (Abb. 2i). Dieser Anstieg der pSMAD2 / 3-Spiegel fehlte in Myotuben, die mit AAV6-GDF11PRO-Fc behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass die GDF11PRO-Fc-Expression die GDF11 / MSTN-induzierte Aktivierung von SMAD2 / 3 in differenzierten Myotuben antagonisiert. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass GDF11PRO-Fc in der Lage war, eine rGDF11- und rMSTN-induzierte Myotubusatrophie und eine Hemmung der Differenzierung in C2C12-Zellen zu verhindern.

Lokalisierte GDF11PRO-Fc-Expression induziert Skelettmuskelhypertrophie bei erwachsenen Mäusen

Zuvor haben wir gezeigt, dass die systemische AAV-Vektor-vermittelte Genübertragung von GDF11PRO-Fc in neugeborene Mäuse zu einer signifikanten Erhöhung der Rate des Skelettmuskelwachstums führte . Aus dieser Studie ging jedoch nicht hervor, ob GDF11PRO-Fc einfach das Skelettmuskelwachstum verbesserte oder tatsächlich eine Skelettmuskelhypertrophie induzierte. Darüber hinaus konnte nicht festgestellt werden, ob die Wirkungen von GDF11PRO-Fc durch eine lokale Blockade von GDF11 / MSTN im Skelettmuskel vermittelt wurden oder ob die beobachteten Wirkungen auf eine systemische Modulation von GDF11 / MSTN zurückzuführen waren. Um diese Fragen zu beantworten, untersuchten wir die Auswirkungen der intramuskulären Verabreichung von AAV9-GDF11PRO-Fc bei erwachsenen C57BL / 6J-Mäusen. In diesen Studien wurde nur das rechte Hinterbein injiziert, und das kontralaterale linke Hinterbein wurde als Kontrolle verwendet.

Bei Mäusen, die mit AAV9-GDF11PRO-Fc behandelt wurden, nahm das Körpergewicht mit der Zeit leicht zu (+ 10% nach 10 Wochen; p = 0,0418; Abb. 3a). Darüber hinaus war die auf das Körpergewicht normierte Griffstärke der einzelnen Hinterbeine in beiden einzeln getesteten Gliedmaßen signifikant erhöht, wobei die größere Wirkung in der behandelten rechten Hinterbeine (+ 37%; p = 0,0177) beobachtet wurde, obwohl auch eine signifikante Zunahme der normalisierten Griffstärke in der unbehandelten linken Hinterbeine (+ 18%; p = 0,0426) beobachtet wurde. Dieser Unterschied erreichte jedoch keine Signifikanz, wenn beide Hinterbeine gleichzeitig getestet wurden (+ 15%; p = 0,2375; Abb. 3b). Zehn Wochen nach Vektorgabe war das rechte Hinterbein bei Mäusen, die mit AAV9-GDF11PRO-Fc behandelt wurden, sichtbar größer (Abb. 3c). Bei Mäusen, die mit AAV9-GDF11PRO-Fc behandelt wurden, war die feuchte Gewebemasse der injizierten rechtsseitigen Tibialis anterior (+ 50%; p = 0,0046) und Gastrocnemius (+ 37%; p = 0,0023) im Vergleich zu vehikelbehandelten Kontrollen signifikant höher. Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Nassgewebemasse der unbehandelten linken Hintergliedmuskulatur (Abb. dreidimensional). Die Myofaserflächenanalyse ergab eine Zunahme der durchschnittlichen Myofaserquerschnittsfläche (+ 15%; p = 0.0078) im AAV9-GDF11PRO-Fc-injizierten rechten Gastrocnemius (Abb. 3e und f). Die MFD-Verteilungsanalyse ergab auch eine Verschiebung hin zu größeren Myofasern im rechten Gastrocnemius von Mäusen, denen AAV9-GDF11PRO-Fc injiziert wurde (Abb. 3g), was darauf hinweist, dass die lokalisierte GDF11PRO-Fc-Expression eine Muskelhypertrophie induzierte. In einer separaten Kohorte untersuchten wir auch die Auswirkungen der lokalisierten Genabgabe von GDF11 durch eine intramuskuläre Injektion von AAV9-GDF11 in das rechte Hinterbein, und 10 Wochen nach der Behandlung wurde eine signifikante Muskelatrophie im injizierten Hinterbein beobachtet (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S4).

GDF11PRO-Fc induziert eine lokalisierte Skelettmuskelhypertrophie nach intramuskulärer Genabgabe. 8 Wochen alte C57BL / 6J-Mäuse wurden mit AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 5) oder Vehikel (n = 5) durch einseitige intramuskuläre Injektion in die rechte Hintergliedmaßen behandelt. Das kontralaterale linke Hinterbein wurde nicht behandelt. Mäuse wurden 10 Wochen nach der Behandlung eingeschläfert. ein durchschnittliches Körpergewicht im Laufe der Zeit. b Die Griffstärke der Hintergliedmaßen normalisierte sich 10 Wochen nach der Behandlung auf das Körpergewicht. Gezeigt sind Messungen von einem einzelnen Hintergliedmaßen und beiden Hintergliedmaßen. c. grobe Hintergliedmuskulatur. Das injizierte Hinterbein ist mit einem schwarzen Pfeil gekennzeichnet. d Nasses Gewebegewicht von Tibialis anterior und Gastrocnemius. e Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von injizierten rechten Gastrocnemius-Querschnitten, die mit AlexaFluor-488-konjugiertem WGA gefärbt wurden, um Myofasern sichtbar zu machen. Skalenbalken repräsentieren 100 µm. f Durchschnittliche Myofaserquerschnittsfläche im injizierten rechten Gastrocnemius. g Myofaser-MFD-Verteilung im injizierten rechten Gastrocnemius. Pro Maus wurden mindestens 500 Myofasern gemessen. h Western Blot Identifizierung von GDF11PRO-Fc in Gewebelysaten aus injizierten rechten Gastrocnemius und Leberproben von behandelten Mäusen. GDF11PRO-Fc war in vehikelbehandelten Mäusen nicht nachweisbar. Die gleiche Proteinbeladung wurde durch Ponceau S-Färbung verifiziert und GAPDH wurde als Beladungskontrolle verwendet. Alle Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar. *p < 0,05; **p < 0,01; n.s. nicht signifikant; im Vergleich zur fahrzeugbehandelten Kontrolle. TA tibialis anterior, Gas gastrocnemius

Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass das GDF11PRO-Fc-Protein im AAV9-GDF11PRO-Fc-injizierten rechten Gastrocnemius exprimiert wurde (58 kDa-Bande; Abb. 3h). GDF11PRO-Fc war jedoch im unbehandelten linken Gastrocnemius bei gleicher beladener Gesamtproteinmenge nicht nachweisbar, was darauf hindeutet, dass der Großteil der GDF11PRO-Fc-Expression des Skelettmuskels am injizierten rechten Hintergliedmaßen lokalisiert war (Daten nicht gezeigt). GDF11PRO-Fc war auch in der Leber durch Western Blot nachweisbar, was darauf hinweist, dass eine gewisse systemische Exposition aufgetreten war (Abb. 3h). Diese Beobachtung kann höchstwahrscheinlich auf ein vaskuläres Austreten des AAV9-Vektors in den systemischen Kreislauf von der Injektionsstelle zurückgeführt werden . Aus diesen Daten stellen wir fest, dass GDF11PRO-Fc bei erwachsenen Mäusen eine Skelettmuskelhypertrophie induziert. Darüber hinaus werden diese Effekte zumindest teilweise durch eine lokale Blockade von GDF11 / MSTN am Skelettmuskel vermittelt, wahrscheinlich durch Hemmung der Ligandeninteraktionen mit ActRII am Skelettmuskelgewebe.

Die systemische GDF11PRO-Fc-Genabgabe erhöht die Skelettmuskelmasse und -stärke in mdx-Mäusen

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen der systemischen GDF11PRO-Fc-Expression in mdx-Mäusen, um festzustellen, ob GDF11PRO-Fc auch Hypertrophie induzieren und die Stärke in dystrophischen Skelettmuskeln erhöhen könnte. Für die Zwecke dieser Studie wurde das GDF11PRO-Fc-Konstrukt mit einer Mutation modifiziert, um es für die endogene BMP1 / TLD-ähnliche Metalloproteinase-Spaltung (GDF11PRO-Fc D122A) undurchlässig zu machen und die Faktorpersistenz im systemischen Kreislauf zu erhöhen . Für diese Experimente wurden sowohl AAV9-GDF11PRO-Fc als auch AAV9-GDF11PRO-Fc D122A ausgewertet, um festzustellen, ob das mutierte D122A-Transgen in vivo zu einer stärkeren Wirkung führen würde. Um eine systemische Expression zu erreichen, wurden mdx-Mäuse mit Vektor oder Vehikel durch Schwanzveneninjektion behandelt. Nach intravenöser Verabreichung transduziert der AAV9-Vektor die Mausleber mit hoher Effizienz. Transduzierte Hepatozyten können dann das Transgen exprimieren und das Proteinprodukt in den systemischen Kreislauf absondern .

Ab 3 Wochen nach der Injektion beobachteten wir einen signifikanten Anstieg des Körpergewichts, der für die Dauer der Studie mit AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 7, 7% nach 12 Wochen; p = 0, 0094) und AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 11% nach 12 Wochen; p = 0, 006) anhielt (Abb. 4a). Es sollte beachtet werden, dass mdx-Mäuse aufgrund der dystrophischen Pathologie typischerweise eine kompensatorische Muskelhypertrophie aufweisen, die den durch die GDF11PRO-Fc-Expression induzierten Anstieg der Muskelmasse teilweise maskieren kann. In Bezug auf Muskelfunktionstests zeigten die behandelten Mäuse eine erhöhte Griffkraft der Vorderbeine, selbst nachdem sie sich auf das Körpergewicht normalisiert hatten. Der Unterschied in der normalisierten Griffstärke der Vorderbeine erreichte jedoch nur statistische Signifikanz in der AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-Gruppe. 12 Wochen nach der Behandlung war die durchschnittliche normalisierte Griffstärke der Vorderbeine bei Mäusen, die mit AAV9-GDF11PRO-Fc bzw. AAV9-GDF11PRO-Fc D122A behandelt wurden, um + 28% (p = 0,0873) bzw. + 36% (p = 0,0248) erhöht (Abb. 4b). Die Rotarod-Leistung wurde auch durch eine durchschnittliche AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-Behandlung verbessert (+ 93% Erhöhung der Rotarod-Latenzzeit; p = 0,0127). Die Rotarod-Leistung wurde auch in der AAV9-GDF11PRO-Fc-Gruppe verbessert, aber dieser Unterschied erreichte keine statistische Signifikanz (+ 44% Zunahme der Rotarod-Latenzzeit; p = 0,2835; Abb. 4c). In keiner der Gruppen wurde ein Unterschied in der Laufbandlaufzeit beobachtet (Abb. 4d).

GDF11PRO-Fc verbessert grip festigkeit und rotarod leistung in dystrophischen mdx mäuse. 6 Wochen alte mdx-Mäuse wurden mit AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) oder Vehikel (n = 7) über eine Schwanzveneninjektion behandelt. ein durchschnittliches Körpergewicht im Laufe der Zeit. b Die Griffstärke der Vorderbeine normierte sich im Laufe der Zeit auf das Körpergewicht. c Beste rotarod Time-to-Fall aufgezeichnet von der Vorbehandlung (Baseline) und 12 Wochen nach der Behandlung. Die beste Zeit aus drei Versuchen wurde zur Analyse verwendet. d Gesamtstreckenlauf auf dem Laufband Ausdauertest vor der Behandlung (Baseline) und 12 Wochen nach der Behandlung. Alle Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar. *p < 0,05; **p < 0,01; n.s. nicht signifikant; Im Vergleich zur vehikelbehandelten Kontrolle

Am Ende der 12-wöchigen Studie war die Muskelhypertrophie grob in den behandelten Mäusen (Fig. 5a). Die durchschnittlichen feuchten Gewebemassen von Tibialis anterior, Gastrocnemius und Quadrizeps waren um + 17% (p = 0,0472), + 20% (p = 0,0011) und + 14% (p = 0) erhöht.0333) jeweils in der AAV9-GDF11PRO-Fc-Gruppe. In der AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-Gruppe wurden diese Werte weiter erhöht auf + 26% (p = 0,0030), + 31% (p = 0,0003) und + 23% (p = 0,0009) über fahrzeugbehandelte Kontrolle für die Änderung der durchschnittlichen Tibialis anterior Masse, Gastrocnemius Masse und Quadrizeps Masse. Zusätzlich wurde die Membranfeuchtgewebemasse in den Gruppen AAV9-GDF11PRO-Fc bzw. AAV9-GDF11PRO-Fc D122A um + 19% (p = 0,0162) und + 26% (p = 0,0014) erhöht. Interessanterweise wurde die Herzmasse durch die Behandlung nicht signifikant verändert. Die durchschnittliche Gastrocnemius-Myofaser-Querschnittsfläche war bei Mäusen, die mit AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 23%; p = 0,0226) und AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 25%; p = 0,0170; Abb. 5c und d). In der MFD-Verteilungsanalyse tendierte die MFD dazu, über alle Gruppen hinweg einen Peak von etwa 20-30 µm zu erreichen, was wahrscheinlich auf den höheren Anteil kleiner regenerierender Myofasern im dystrophischen Muskel zurückzuführen ist. Die Behandlung mit AAV9-GDF11PRO-Fc und AAV9-GDF11PRO-Fc D122A führte jedoch zu einem erhöhten Anteil von Myofasern mit MFDs von mehr als 64 µm, was darauf hindeutet, dass die Faktorexpression eine Myofaserhypertrophie induziert hatte (Abb. 5e) im Skelettmuskel.

GDF11PRO-Fc induziert Skelettmuskelhypertrophie bei dystrophischen mdx-Mäusen. 6 Wochen alte mdx-Mäuse wurden mit AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) oder Vehikel (n = 7) über eine Schwanzveneninjektion behandelt. Mäuse wurden 12 Wochen nach der Behandlung eingeschläfert. ein Vertreter der Hintergliedmuskulatur. b Nasses Gewebegewicht der Extremitätenmuskeln, des Zwerchfells und des Herzens. c Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von Gastrocnemius-Querschnitten, die mit AlexaFluor-488-konjugiertem WGA gefärbt wurden, um Myofasern sichtbar zu machen. Skalenbalken repräsentieren 100 µm. d Durchschnittliche Myofaserquerschnittsfläche im Gastrocnemius. e Myofaser MFD Verteilung im Gastrocnemius. Pro Maus wurden mindestens 500 Myofasern gemessen. f Identifizierung von GDF11PRO-Fc durch Western Blot in Lebergewebslysat und Serum von Mäusen, die mit AAV9-GDF11PRO-Fc behandelt wurden. Die gleiche Proteinbeladung wurde durch Ponceau S-Färbung verifiziert und GAPDH wurde als Beladungskontrolle in Lebergewebelysaten verwendet. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; n.s. nicht signifikant; im Vergleich zur fahrzeugbehandelten Steuerung

Die Western-Blot-Analyse bestätigte die Proteinexpression der Transgene in Leber und Serum. Wie erwartet war die Bande bei 58 kDa, die dem GDF11PRO-Fc oder GDF11PRO-Fc D122A in voller Länge entsprach, in behandelten Mäusen nachweisbar. Die Serumspiegel des Propeptids in voller Länge waren bei Mäusen, die mit AAV9-GDF11PRO-Fc D122A behandelt wurden, geringfügig höher als bei Mäusen, die mit AAV9-GDF11PRO-Fc behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass die Serumpersistenz des aktiven Propeptids durch die D122A-Mutation erhöht war (Abb. 5f).Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die systemische Expression von GDF11PRO-Fc und GDF11PRO-Fc D122A die Skelettmuskelmasse bei dystrophischen mdx-Mäusen erhöht und dass diese Skelettmuskelhypertrophie mit Verbesserungen der Griffkraft und der motorischen Koordination verbunden ist. Die Behandlung schien jedoch die Muskelausdauer basierend auf der Laufleistung des Laufbandes nicht zu beeinflussen. Darüber hinaus schien die D122A-Mutante bei der Erhöhung der Muskelmasse und -funktion etwas wirksamer zu sein, vermutlich aufgrund einer verbesserten Serumpersistenz.

Die systemische GDF11PRO-Fc-Genabgabe reduziert die dystrophische Pathologie bei mdx-Mäusen nicht

Eine Reihe von Studien hat berichtet, dass eine Blockade der TGF-β-ActRII-SMAD2/ 3-Signalisierung, sei es durch MSTN-Hemmung oder Blockade von ActRII, einen therapeutischen Nutzen in Tiermodellen von DMD haben kann . Um den Einfluss der AAV9-GDF11PRO-Fc-Behandlung auf die dystrophische Pathologie zu bestimmen, führten wir eine histologische Analyse der Extremitätenmuskulatur und des Zwerchfells durch.

Charakteristische Anzeichen der dystrophischen Pathologie, einschließlich Muskelnekrose, zentraler Keimbildung, intramuskulärer Kollagenablagerung und Vorhandensein entzündlicher Infiltrate, waren in allen mdx-Gruppen offensichtlich (Abb. 6a). Im Gastrocnemius war der fibrotische Flächenanteil bei mit AAV9−GDF11PRO-Fc behandelten Mäusen um – 39% (p = 0,0273) reduziert. Die Fibrose im Gastrocnemius war auch in der AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-Gruppe leicht verringert; aufgrund der hohen Intersubjektvariabilität bei der intramuskulären Fibrose der Gliedmaßenmuskulatur erreichte dieser Unterschied jedoch keine statistische Signifikanz (- 28%; p = 0,1230; Abb. 6b). Es wurde auch kein signifikanter Unterschied im Anteil der zentral kernhaltigen Myofasern beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Myofaserregeneration in allen Gruppen aktiv war (Abb. 6c). Serum-CK, ein Marker für den Muskelabbau, wurde durch die Behandlung ebenfalls nicht signifikant verändert (Abb. 6d). Darüber hinaus war eine lokalisierte Verschlechterung der Integrität der Myofasermembran, gemessen durch Anti-Maus-IgG-Immunfluoreszenz-Färbung, in allen mdx-Gruppen offensichtlich. Unerwartet zeigten mdx-Mäuse, die mit AAV9-GDF11PRO-Fc D122A behandelt wurden, im Durchschnitt einen leichten Anstieg der IgG-positiven Fläche, aber dieser Unterschied erreichte keine statistische Signifikanz (+ 55%; p = 0,1729; Abb. 6e und f; Zusätzliche Datei 1: Abbildung S5). Offensichtliche Anzeichen von Myofasernekrose, Regeneration, zentraler Keimbildung und IgG-Penetranz waren beim Wildtyp C57BL / 10J gastrocnemius nicht erkennbar, was darauf hinweist, dass diese Marker spezifisch für die dystrophische Pathologie sind (Abb. 6a-f; Zusätzliche Datei 1: Abbildung S5) .

GDF11PRO-Fc mildert die dystrophische Pathologie bei mdx-Mäusen nicht. 6 Wochen alte mdx-Mäuse wurden mit AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) oder Vehikel (n = 7) über eine Schwanzveneninjektion behandelt. Altersangepasste C57BL/10J (n = 5) Mäuse wurden ebenfalls als Wildtyp-Kontrolle eingeschlossen. Mäuse wurden 12 Wochen nach der Behandlung eingeschläfert. eine repräsentative HE- und MTC-Färbung aus Gastrocnemius-Querschnitten von C57BL / 10J- und mdx-Mäusen. Die zentrale Keimbildung ist in allen mdx-Gruppen offensichtlich. Lokalisierte Bereiche der Myofasernekrose und Regeneration sind mit einem schwarzen Pfeil markiert. Der fibrotische Bereich wird durch die blaue Region bei der MTC-Färbung dargestellt. Skalenbalken repräsentieren 50 µm in HE-Abschnitten und 100 µm in MTC-Abschnitten. b Fibrotische Fläche im Gastrocnemius ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Muskelquerschnittsfläche. c Prozentsatz der Myofasern, die eine zentrale Keimbildung aufweisen. d Messung der zirkulierenden Serumspiegel CK, ein Marker für Muskelschäden. e Repräsentative Immunfluoreszenzbilder der Maus-IgG-Färbung (rot) in Gastrocnemius-Gewebequerschnitten. Positive Färbung für IgG zeigt Myofaserpermeabilität für Serumproteine und Verlust der Membranintegrität. Schnitte wurden mit WGA co-gefärbt, um einzelne Myofasern zu visualisieren. Der vergrößerte Bereich ist mit einem weißen Feld markiert. Charakteristische IgG-positive Myofasern sind mit einem weißen Pfeil dargestellt. Skalenbalken repräsentieren 100 µm. f Die Fläche der IgG-positiven Myofasern, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Muskelquerschnittsfläche. g Repräsentative HE- und MTC-Färbung aus Membranquerschnitten von C57BL / 10J- und mdx-Mäusen. Umfangreiche Pathologie ist offensichtlich in mdx, aber nicht C57BL / 10J Mäuse. Skalenbalken repräsentieren 100 µm. h Fibrotische Fläche im Zwerchfell ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Querschnittsfläche. *p < 0,05; ***p < 0,001; ****p < 0,0001; n.s. nicht signifikant; im Vergleich zu vehikelbehandelten mdx-Kontrollen

Im Zwerchfell zeigte die H&E-Färbung eine ausgedehnte Nekrose und intramuskuläre Kollagenablagerung sowohl in behandelten als auch in unbehandelten MDX-Gruppen (Abb. 6g). Ähnlich wie beim Gastrocnemius-Muskel führte die Behandlung mit AAV9-GDF11PRO-Fc oder AAV9-GDF11PRO-Fc D122A insgesamt zu einer leichten Verringerung der intramuskulären Fibrose des Zwerchfells. Der durchschnittliche fibrotische Flächenanteil im Diaphragma war um 15% (p = 0,0328) und 17% (p = 0) reduziert.019) mit AAV9-GDF11PRO-Fc bzw. AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-Behandlung (Abb. 6h). Wie erwartet fehlten diese pathologischen Merkmale im Zwerchfell von Wildtyp-C57BL / 10J-Mäusen weitgehend (Abb. 6g und h). Aus diesen Daten bestimmen wir, dass GDF11PRO-Fc und GDF11PRO-Fc D122A sind in der Lage, die intramuskuläre Kollagenablagerung in den Extremitätenmuskeln und im Zwerchfell über einen Zeitraum von 3 Monaten leicht zu hemmen. Die Behandlung scheint jedoch den anhaltenden Zyklus der Muskeldegeneration und -regeneration im Gastrocnemius oder Zwerchfell von erwachsenen mdx-Mäusen nicht zu stoppen.