single beam scanning spectrophotometer

det finns två huvudklasser av enheter: single beam och double beam. En dubbelstrålespektrofotometer jämför ljusintensiteten mellan två ljusbanor, en väg som innehåller ett referensprov och den andra testprovet. En spektrofotometer med en stråle mäter strålens relativa ljusintensitet före och efter att ett prov har satts in. Även om jämförelsemätningar från dubbelstråleinstrument är enklare och mer stabila, kan enstråleinstrument ha ett större dynamiskt omfång och är optiskt enklare och mer kompakta. Dessutom är vissa specialiserade instrument, såsom spektrofotometrar byggda på mikroskop eller teleskop, enstråleinstrument på grund av praktiska egenskaper.historiskt använder spektrofotometrar en monokromator innehållande ett diffraktionsgaller för att producera det analytiska spektrumet. Gallret kan antingen vara rörligt eller fast. Om en enda detektor, såsom ett fotomultiplikatorrör eller fotodiod används, kan gallret skannas stegvis (skanningsspektrofotometer) så att detektorn kan mäta ljusintensiteten vid varje våglängd (vilket motsvarar varje ”steg”). Arrayer av detektorer (array spektrofotometer), såsom laddningskopplade enheter (CCD) eller fotodiodarrayer (PDA) kan också användas. I sådana system fixeras gallret och intensiteten hos varje våglängd av ljus mäts med en annan detektor i matrisen. Dessutom använder de flesta moderna Mid-infraröda spektrofotometrar en Fourier-transformationsteknik för att förvärva spektralinformationen. Denna teknik kallas Fourier transform infraröd spektroskopi.

vid överföringsmätningar jämför spektrofotometern kvantitativt fraktionen av ljus som passerar genom en referenslösning och en testlösning, jämför sedan elektroniskt intensiteten hos de två signalerna och beräknar procentandelen överföring av provet jämfört med referensstandarden. För reflektansmätningar jämför spektrofotometern kvantitativt den fraktion av ljus som reflekterar från referens-och testproverna. Ljus från källlampan passeras genom en monokromator, som diffrakterar ljuset i en ”regnbåge” av våglängder genom ett roterande prisma och matar ut smala bandbredder av detta diffrakterade spektrum genom en mekanisk slits på monokromatorns utgångssida. Dessa bandbredder överförs genom testprovet. Därefter mäts fotonflödestätheten (watt per meter kvadrat vanligtvis) av det överförda eller reflekterade ljuset med en fotodiod, laddningskopplad enhet eller annan ljussensor. Transmittans-eller reflektansvärdet för varje våglängd i provprovet jämförs sedan med överförings-eller reflektansvärdena från referensprovet. De flesta instrument kommer att tillämpa en logaritmisk funktion på det linjära transmittansförhållandet för att beräkna provets absorptionsförmåga, ett värde som är proportionellt mot koncentrationen av den kemikalie som mäts.

kort sagt är sekvensen av händelser i en skanningsspektrofotometer följande:

1. ljuskällan skenas till en monokromator, diffrakteras till en regnbåge och delas upp i två strålar. Det skannas sedan genom provet och referenslösningarna.
2. fraktioner av infallande våglängder överförs genom eller reflekteras från provet och referensen.
3. det resulterande ljuset träffar fotodetektoranordningen, som jämför den relativa intensiteten hos de två strålarna.
4. elektroniska kretsar omvandlar de relativa strömmarna till linjära överföringsprocent och/eller absorbans/koncentrationsvärden.

i en array spektrofotometer är sekvensen som följer:

1. ljuskällan lyses in i provet och fokuseras till en slits
2. det överförda ljuset bryts in i en regnbåge med reflektionsgitteret
3. det resulterande ljuset träffar fotodetektoranordningen som jämför strålens intensitet
4. elektroniska kretsar omvandlar de relativa strömmarna till linjära överföringsprocent och/eller absorbans/koncentrationsvärden

många äldre spektrofotometrar måste kalibreras med ett förfarande som kallas ”nollställning”, för att balansera nollströmutgången för de två strålarna vid detektorn. Överföringen av ett referensämne fastställs som ett basvärde (datum), så överföringen av alla andra ämnen registreras i förhållande till det ursprungliga ”nollställda” ämnet. Spektrofotometern omvandlar sedan överföringsförhållandet till absorptionsförmåga, koncentrationen av specifika komponenter i provprovet i förhållande till den ursprungliga substansen.

tillämpningar inom biokemiredigera

spektrofotometri är en viktig teknik som används i många biokemiska experiment som involverar DNA, RNA och proteinisolering, enzymkinetik och biokemiska analyser. Eftersom prover i dessa applikationer inte är lätt tillgängliga i stora mängder, är de särskilt lämpade för att analyseras i denna icke-destruktiva teknik. Dessutom kan värdefullt prov sparas genom att använda en mikrovolymplattform där så lite som 1UL prov krävs för fullständiga analyser. En kort förklaring av förfarandet för spektrofotometri innefattar att jämföra absorptionsförmågan hos ett tomt prov som inte innehåller en färgad förening till ett prov som innehåller en färgad förening. Denna färgning kan åstadkommas genom antingen ett färgämne såsom Coomasie Brilliant Blue G – 250 färgämne mätt vid 595 nm eller genom en enzymatisk reaktion som ses mellan kub-galaktosidas och ONPG (blir provgult) mätt vid 420 nm.: 21-119 spektrofotometern används för att mäta färgade föreningar i det synliga ljusområdet (mellan 350 nm och 800 nm),:65 således kan den användas för att hitta mer information om ämnet som studeras. I biokemiska experiment väljs en kemisk och/eller fysisk egenskap och proceduren som används är specifik för den egenskapen för att härleda mer information om provet, såsom kvantitet, renhet, enzymaktivitet etc. Spektrofotometri kan användas för ett antal tekniker såsom bestämning av optimal våglängdsabsorbans av prover, bestämning av optimalt pH för absorption av prover, bestämning av koncentrationer av okända prover och bestämning av pKa för olika prover.:21-119 spektrofotometri är också en användbar process för proteinrening och kan också användas som en metod för att skapa optiska analyser av en förening. Spektrofotometriska data kan också användas i samband med öl-Lambert ekvationen, A = − log 10 C = CL c = o d {\textstyle a=-\log _{10}t=\epsilon cl=od}

, i ordning för att bestämma olika förhållanden mellan transmittans och koncentration, och absorbans och koncentration.:21-119 eftersom en spektrofotometer mäter våglängden för en förening genom sin färg kan ett färgbindande ämne tillsättas så att det kan genomgå en färgförändring och mätas. Det är möjligt att känna till koncentrationerna av en tvåkomponentblandning med hjälp av absorptionsspektra för standardlösningarna för varje komponent. För att göra detta är det nödvändigt att känna till utrotningskoefficienten för denna blandning vid två våglängder och utrotningskoefficienterna för lösningar som innehåller de kända vikterna för de två komponenterna. Spektrofotometrar har utvecklats och förbättrats under årtionden och har använts i stor utsträckning bland kemister. Dessutom är spektrofotometrar specialiserade för att mäta antingen UV-eller synligt ljus våglängdsabsorbansvärden.: 21-119 det anses vara ett mycket exakt instrument som också är mycket känsligt och därför extremt exakt, särskilt vid bestämning av färgförändring. Denna metod är också lämplig för användning i laboratorieexperiment eftersom det är en billig och relativt enkel process.