den mobila fasen

den mobila fasen i omvänd fas kromatografi är en blandning av vatten eller buffert med ett polärt organiskt lösningsmedel såsom metanol, acetonitril, isopropanol (IPA) eller tetrahydrofuran (THF). Elueringsstyrkan ökar ungefär i denna ordning. Alkoholerna är protongivare medan acetonitril är en protonacceptor. Acetonitril / vattenblandningar har en lägre viskositet jämfört med blandningar av de andra lösningsmedlen med vatten. Detta resulterar i ett lägre mottryck. IPA / vattenblandningar har den högsta viskositeten. På grund av det lägre mottrycket som är resultatet av den lägre viskositeten är de två vanligaste organiska mobilfasmodifierarna acetonitril och metanol. Acetonitril har också en låg absorption i låg UV, mycket mindre än de andra lösningsmedlen.

vatten är den svagaste eluenten i omvänd fas kromatografi. Tillsatsen av metanol eller acetonitril minskar retentionen. Logaritmen för retentionsfaktorn minskar ungefär i proportion till den organiska lösningsmedelskoncentrationen. Om analyten är en liten molekyl som är fallet för de flesta läkemedel, kommer retentionen att minska ungefär sjufaldigt när koncentrationen av metanol i mobilfasen ökar med cirka 20%. Under många omständigheter (t.ex. vid metodutveckling) antas det att det finns ett linjärt förhållande mellan logaritmen för retentionsfaktorn och volymfraktionen för den organiska modifieraren i mobilfasen. Man bör dock bara betrakta detta som en bra tumregel, som varken är korrekt eller teoretiskt motiverad.

på grund av lösningsegenskaperna hos acetonitril jämfört med metanol resulterar utbytet av ett lösningsmedel med det andra ofta i en förändring i analyternas elueringsordning (Figur 2). Därför används denna teknik ofta i metodutveckling. Förändringen från en modifierare till en annan skapar mer signifikanta selektivitetsförändringar än förändringen av lösningsmedelsstyrkan ensam (dvs genom att helt enkelt ändra koncentrationen av det organiska lösningsmedlet). THF ändrar också selektiviteten drastiskt. Faktum är att de största selektivitetsförändringarna ofta orsakas av att vissa metanol eller acetonitril ersätts med THF. Men av flera skäl, såsom dess obehagliga lukt, bildandet av peroxider och ogynnsam UV-transparens, används den inte så ofta.

Figur 2. Påverkan av mobilfasmodifieraren på separationens selektivitet. Topp, acetonitril; botten, metanol. Kolumn: XTerra RP18, 4,6 mm 50 mm, 3,5. Gradient vid 2 ml min – 1 över 15 min från 0 till 80% organiskt vid pH 3 med ammoniumformiat. Analyter: 1, triamteren; 2, klortalidon; 3, althiazid; 4, furosemid; 5, benstiazid; 6, probenecid; 7, etakrynsyra; 8, bumetanid; 9, kanrensyra. (Kromatogram tillhandahålls av Diane Diehl och Kim Tran, Waters Corporation.)

tolkningen av lösningsmedelsselektivitet kompliceras av det faktum att det organiska lösningsmedlet adsorberas av liganderna i stationär fas och kan anses vara en del av den stationära fasen. Nyligen har flera författare mätt ytöverskottet av de organiska modifierarna för stationära faser av standard C18-typ och har funnit signifikanta skillnader i ytlösningen mellan acetonitril och metanol.

det nämndes i början av detta avsnitt att metanol ger högre retention än acetonitril. Detta är ännu mer uttalat för joniserade föreningar än för nonioniserade föreningar. Detta är vettigt ur ståndpunkten att den adsorberade metanolen i den stationära fasen underlättar penetrationen av de joniserade molekylerna i den stationära fasen. Samma mönster Finns när metanol jämförs med THF. Dessa är användbara funktioner i metodutveckling. Å andra sidan visar föreningar med sulfonamidfunktionella grupper relativt mer retention i THF, jämfört med en grupp referensanalyter. Sammantaget kan ett signifikant inflytande av det organiska lösningsmedlet på selektiviteten hos en separation observeras, men en rationalisering är svår, eftersom lösningsmedlet kan hittas i både den stationära och den mobila fasen. Vissa författare har också försökt skilja mobila faser med högt vatteninnehåll från låga vatteninnehåll.

som nämnts ovan är de viktiga selektivitetsskillnaderna mellan de olika lösningsmedlen ett mycket användbart verktyg vid utvecklingen av omvänd fasavskiljningar. Klassiska metodutvecklingsscheman har använt metanol, acetonitril och THF som organiska modifierare i mobilfasen. Mellanliggande selektivitet kan erhållas med lösningsmedelsblandningar, och en justering av toppavstånd kan åstadkommas utan svårighet. Moderna metodutvecklingssystem använder temperatur som en annan lätt kontrollerbar variabel vid justering av selektivitet.

en viktig aspekt av mobilfasens selektivitet är dess pH. kontrollen av retentionen av joniserbara föreningar med hjälp av buffertar eller syra-eller basadditiv till mobilfasen är mycket viktig. Genom att noggrant välja mobilfas pH kan man underlätta manipulering av retention och selektivitet. Som nämnts ovan kan skillnaden i retention mellan den joniserade och den nonioniserade formen av en analyt vara 10 – till 30-faldig, och pH-kontroll är viktig.

under de senaste åren har forskning visat att både pH och joniseringskonstanterna hos bufferten förändras när organiska lösningsmedel tillsätts till den. Detta har viktiga konsekvenser för kontrollen av retention. Man kan vanligtvis komma till en definierad jonisering av analyten om pH-värdet i mobilfasen är 2 pH-enheter från analytens PKA. Men om pH och analyt pKa båda förändras med tillsats av organiskt lösningsmedel är det inte lätt att hantera med enkla regler. Därför är en bra pH-kontroll och en bra buffert viktiga element i reproducerbarheten av en omvänd fasseparation av joniserbara analyter. PH mäts i vatten, där man är bekant med pKa-värdena för de vanliga buffertarna, och man föredrar att hålla sig nära dessa pKa-värden. Den maximala buffertkapaciteten finns vid buffertens PKA. Medan pH förändras i närvaro av det organiska lösningsmedlet, gör buffertkapaciteten inte. För utövaren av omvänd fas kromatografi är detta en viktig aspekt av retentionskontroll. Å andra sidan måste utredaren av retentionsmekanismer med omvänd fas förberedas för att mäta pH i närvaro av det organiska lösningsmedlet för att fullt ut förstå dess inflytande på retentionen. Typiskt resulterar tillsatsen av det organiska lösningsmedlet i en ökning av PKA av syror och i en minskning av pKa för baser. Detta gäller både buffertar och analyter. Detta kan resultera i en signifikant förändring i det förväntade joniseringsmönstret för en analyt. Här är ett exempel som illustrerar detta: en amin med en pKa på 9 joniseras fullständigt i en fosfatbuffert vid pH 7 i vatten, men den får endast halvjoniseras i samma buffert efter tillsats av 70% metanol. Det är uppenbart att sådana effekter är betydande. Därför är ett exakt sätt att förbereda en buffert och att kontrollera dess pH avgörande för en god kontroll av den omvända fasretentionen av joniserbara analyter.

andra joniska interaktioner påverkar retentionen och selektiviteten hos en omvänd fasseparation av joniserade analyter också. Ett klassiskt verktyg för att öka retentionen av joniska analyter är jonparkromatografi. I denna teknik jämviktas den stationära fasen med en hydrofob laddad jon, såsom en långkedjig sulfonsyrajon (t.ex. oktylsulfonat) eller en hydrofob kvaternär amin (t. ex. tetrabutylammoniumjonen). En typisk mobilfaskoncentration är cirka 10 mm. tillsatsen av jonparreagensen till mobilfasen ökar retentionen av måljoner, minskar retentionen av joner med samma laddning som jonparreagenset och lämnar retentionen av neutrala analyter inklusive zwitterioner nästan opåverkad. Således är det ett utmärkt verktyg för att justera selektiviteten hos en separation. Anledningen till dessa förändringar i selektiviteten är det faktum att jonparreagensen adsorberas på ytan av den stationära fasen. Den enklaste tolkningen av den resulterande retentionsmekanismen är en kombination av jonbyte med den omvända fasmekanismen. När koncentrationen av jonparreagensen i mobilfasen ökar ökar retentionen av motsatt laddade analyter initialt och nivåer sedan av vid högre koncentrationer. För jonparreagenser med olika kedjelängd ökar retentionen snabbare med en längre kedjelängd.

en annan joninteraktionseffekt som påträffas med katjoniska analyter är ökningen av retentionen när små oorganiska motjoner tillsätts till mobilfasen. De koncentrationer som krävs är vanligtvis cirka 10 gånger högre än de koncentrationer som används med jonparreagenser. Typiska anjoner av denna typ är perklorat (ClO4−), tetrafluoroborat (BF4−) eller hexafluorfosfat (PF6−). De ökar retentionen av katjoniska analyter avsevärt. Effekten är mer uttalad med acetonitril som mobilfasadditiv än med metanol. Detta förklaras av ett tjockare lager av acetonitril adsorberat på den stationära fasen jämfört med ett monomolekylärt lager av metanol och partitioneringen av motjonen i detta skikt. Ur användarnas synvinkel är retentionsbeteendet hos katjoniska analyter i närvaro av dessa oorganiska anjoner inte annorlunda än det som observerats med sanna jonparreagenser, dvs med långkedjiga sulfonsyror.