diagnos

klinisk diagnos: klinisk bild av patienter som lider av klamydiainfektion kan vara vilseledande eftersom upp till 70-80 procent av de infekterade kvinnorna och 50 procent av de infekterade männen är asymptomatiska. Vanligtvis kommer en kvinna med okomplicerad chlamydialinfektion att presentera luktfri, mucoid vaginal urladdning utan klåda. Dysuri utan frekvens eller brådskande kommer att klagas på om urinröret är involverat. Vidare, i PID, kan historia av svår buksmärta med hög feber, dyspareuni, långvariga menstruationscykler och intermenstural blödning framkallas. Vid undersökning kan cervicit med en gul, grumlig, mucoid urladdning ses från operativsystemet. Livmoderhalsen tenderar att blöda lätt när den skrapas med spatel eller borste. Urinalys kommer att avslöja närvaron av > 5 WBC/HPF (high power field), vilket tyder på uretrit13. Klamydiala infektioner kan inte särskiljas från andra urinvägsinfektioner kliniskt. Amintest (dvs., signifikant luktfrisättning vid tillsats av KOH till vaginalsekretionen) kan hjälpa till att skilja chlamydiala infektioner från andra nedre genitala infektioner men har låg specificitet.

Chlamydial infektion hos män manifesterar sig som uretrit hos 15-55 procent av de drabbade mindre än eller lika med 35 år, ibland kan epididymit ses2. Mild till måttlig klar till vit urinrörsutsläpp ses på morgonen innan patienten tomrum. Vid epididymit kan historia av ensidig testikelsmärta med scrotal erytem, ömhet eller svullnad över epididymis framkallas. Diagnosen kan fastställas genom närvaron av mucopurulent urladdning från penis som på Gramfärgning visar >5 WBC/HPF och frånvaro av intracellulära gramnegativa diplokocker. Reiters syndrom kan vara en sällsynt komplikation av obehandlad chlamydialinfektion. En reaktiv artrit som inkluderar Triad av uretrit / cervicit hos kvinnor, konjuntivit och smärtfri mucopurulent utbrott på handflator och fotsulor ses i Reiters syndrom29. Kvinnor drabbas oftare än män. Det finns asymmetriska flera gemensamma involveringar med förkärlek för nedre extremiteter.

laboratoriediagnos: sjukdomens asymptomatiska natur och det ökande spektrumet av infektioner orsakade av C. trachomatis betonar behovet av känsliga och pålitliga laboratoriemetoder.

kunskaper i provsamling och transport är av största vikt för noggrannhet vid diagnostisk testning. Både känsligheten och specificiteten hos diagnostiska tester för C. trachomatis har visat sig vara direkt relaterade till provets tillräcklighet. Värdcellerna som innehåller organismen bör ingå i provsamlingen eftersom klamydierna är obligatoriska intracellulära patogener, särskilt i tekniker som involverar direkt visualisering av organismen.

valet av provtagningsställen kan påverka sannolikheten för att återställa patogenen. En ökning med 10-20 procent av återhämtningen av C. trachomatis från könsorganen har observerats om både livmoderhals-och urinrörsprover tas i jämförelse med endast livmoderhalsprovtagning42. Endocervikal swab, vaginal/introital swab, vulval swab samt urinrör och rektal swab och första fångsturin är de vanliga proverna som tagits från kvinnliga patienter. Urinrör och rektal swab och första fångsten urinprov kan också samlas in från manliga patienter utöver andra specifika prover som prostatavätska.kvalitetssäkring av insamling och transport av provet: provets tillräcklighet kan bestämmas genom visualisering av squamo-kolumnar celler under mikroskopi. Ett prov anses vara tillräckligt om det innehåller en kolumnär/metaplastisk cell per bild. Sannolikheten för isolering optimeras om provet kyls omedelbart efter insamling vid 2-8 C. tiden mellan provsamling och bearbetning bör helst vara mindre än 48 h, om det inte är möjligt kan dessa frysas vid -70 C C tills de bearbetas16. Fetalt bovint serum (2-5%) bidrar till att bevara livskraften hos klamydia i provet som ska frysas. Två-molärt sackarosfosfat (2-MSP) eller sackarosglutamatfosfat är det vanligaste transportmediet. Syntetiska transportmedier för kultur och vissa icke-kulturtester har utvecklats och godkänts för diagnostisk användning, dvs. M4 transportmedium, Flex Trans medium och nytt M4 syntetiskt/universellt medium.

laboratoriediagnosen av klamydia består av följande metoder:

(i) specifika tester

cellkultur: isolering av organismen är den definitiva metoden för diagnos av chlamydialinfektion. Klamydia är en obligatorisk intracellulär patogen och kräver därför embryonerade hönsägg eller djurcellinjer för odling. Sådana odlingsmetoder är tekniskt svåra, arbetsintensiva, besvärliga och dyra och har inte antagits allmänt som ett rutintest utfört i allmänna kliniska laboratorier. Tre in vitro-system har emellertid använts för odling av chlamydiae, nämligen. musinokulering( intraperitoneal, intrakraniell och intravenös), yolksäck-ympning (7-8 dagar gammal kycklingembryo yolksäck ympning) och cellodlingslinjer16. De vanligaste cellinjerna inkluderar-HeLa 229 celler, McCoy celler, BHK21 och BGMK cells24.

cellodlingens känslighet för isolering av klamydia förstärks genom förbehandling av cell genom polykationer, deae-dextrans, centrifugering av inokulatet till cellmonoskiktet och införlivande av antimetaboliter såsom cykloheximid eller cytokalasin B i cellodlingsmediet42. Cellmonolager för odling av C. trachomatis odlas i trum-eller skalflaskor på glasöverdrag eller i brunnarna i multiwell-cellodlingsrätter. Skalflaskmetoden är känsligare för kliniska prov än multiwell cellodling på grund av mindre risk för korsförorening42. Före ympning ska provet sonikeras för att störa värdcellerna och för att separera klamydiala inneslutningar. För att inokulera cellkulturerna bör det överliggande odlingsmediet avlägsnas och ersättas med tillräckligt med prov i odlingsmediet för att täcka monoskiktet och förhindra torkning.

det vanligaste tillväxtmediet är Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) kompletterat med aminosyror och vitaminer, fetalt kalvserum (5-10), extra glukos (0,056 m) och 2-glutamin42. Efter ympning inkuberas kulturerna vid 37o C i 2-3 dagar. De chlamydiala inneslutningarna observeras sedan genom immunofluorescerande färgning. Isoleringens känslighet har visat sig sträcka sig från 70-85 procent beroende på vilket laboratorium och vilket odlingssystem som används. Traditionellt är detta ”guldstandarden” för diagnos av C. trachomatis eftersom det är 100 procent specifikt42. Tyvärr är det bortom kapaciteten hos de flesta privata och offentliga laboratorier på grund av dess tekniska efterfrågan, arbetsintensitet och höga kostnader.

direkt fluorescerande test (DFA): Dfa-testet lägger till den stora fördelen med Chlamydia-specifik antikroppsfärgning för direkt undersökning av prov och är fortfarande en av de mest användbara diagnostiska teknikerna. I detta test används snabb identifiering av elementära kroppar i smuts med flouresceinisotiocynate – konjugerade monoklonala antikroppar (FITC-Mab) mot MOMP eller genusspecifika LPS. Elementära kroppar framträder som distinkta, skarpt skisserade, äppelgröna, skivformade (300 nm) partiklar och retikulära kroppar verkar ungefär tre gånger större än elementära kroppar som har en fluorescerande Gloria.

denna procedur kräver inte stränga villkor för provtransport, eftersom en bäddsidautstryk förbereds och därefter transporteras för bearbetning. Vid användning av MOMP av C. trachomatis känsligheten och specificiteten av DFA befinns vara 80-90 procent respektive 98-99 procent i förhållande till kultur43. Den höga specificiteten hos DFA beror på dess beroende av visualisering av särskiljande morfologi och färgningsegenskaper hos chlamydiala inklusioner. DFA är det enda diagnostiska testet som är tillgängligt som möjliggör samtidig bedömning av provets tillräcklighet genom visualisering av epitelceller som finns i smeten. Det är snabbt och enkelt (handläggningstid ca 30 min) men mikroskopisk undersökning och tolkning av resultat kräver expertis. Denna metod rekommenderas därför för laboratorier med låg volym. Detta test kan också tillämpas på extragenitala platser. Det rapporteras vara känsligare än kultur för detektering av klamydia i endometriala eller Tubala prov42.

ELISA (enzymbunden immunosorbantanalys): ELISA är tillgängligt för detektion av C. trachomatis antigen. Flera kommersiellt tillgängliga ELISA-kit finns tillgängliga för ändamålet. De flesta av dessa upptäcker chlamydial LPS som är mer löslig än MOMP. Enzymimmunanalystesterna (MKB) har rapporterats ha en känslighet på 62-96 procent och en specificitet på 86-99 procent jämfört med cellkultur44. Detta test är lämpligt för laboratorier utan tillgång till cellkultur. Men olika stora och små studier över hela världen inklusive Indien har rapporterat dålig känslighet för ELISA jämfört med DFA och PCR45,46,47.

cytologi: cytologi är ett lättillgängligt, enkelt att använda och kostnadseffektivt diagnostiskt test. Det kräver inga försiktighetsåtgärder för lagring och transport av prover, och icke-livskraftiga/icke-infektiösa partiklar kan också detekteras. Kvaliteten på det kliniska provet kan bedömas med den mikroskopiska tekniken och de tekniska förfarandena som används i dessa tester är vanligtvis snabbare och enklare att utföra än kultur. Giemsa, immunoflourescens och jodfärgningsmetoder används oftast. Andra fläckar som immunoperoxidas, immunoferritin, May Grunwald, Giemenez, Macchiavello och akridinorange kan också användas för att upptäcka klamydial inkludering i exfolierade celler. Förekomsten av intracytoplasmiska inklusioner är patogenomisk för klamydiala okulära infektioner hos nyfödda, men denna metod rekommenderas inte för att diagnostisera konjunktivit eller könsinfektion hos vuxna på grund av brist på känslighet. Av de tre metoderna erbjuder immunofluorescens den högsta känsligheten följt av Giemsa och sedan jodfärgning42.

molekylära metoder: De traditionella diagnosmetoderna har flera begränsningar som inkluderar låg känslighet, lång testtid och hög kostnad. Därför utarbetas tester baserade på direkt igenkänning av DNA-och RNA-sekvenser. Den kommersiellt tillgängliga DNA-sonden för detektering av klamydia är PACE 2-test (Sondanalys chemiluminescence förbättrad)48, som också kan detektera Neisseria gonorrhoeae, vilket är en icke-isotop DNA-sond för detektering av specifika delar av r-RNA av C. trachomatis i endocervikal och urinrörsprov. En annan DNA-sond, PACE 2C-test har också utvecklats som samtidigt upptäcker både C. trachomatis och N. gonorrhoeae från ett enda prov; emellertid krävs ytterligare utvärdering av PACE 2C innan den används i diagnostik. Dessa tester använder en kemiluminescerande DNA-sond som hybridiserar till en artspecifik sekvens av chlamydial 16s rRNA. När DNA – rRNA-hybriden har bildats adsorberas den på en magnetisk pärla och det kemiluminescerande svaret detekteras kvantitativt med en luminometer. Eftersom aktivt delande chlamydiae innehåller upp till 104 kopior av 16s rRNA, bör PACE 2-testet teoretiskt vara känsligare än antigendetekteringssystem. Känsligheten för PACE 2 i förhållande till en DNA-förstärkningsstandard har ännu inte utvärderats väl men har rapporterats vara 77 till 93 procent48 i en studie.

utvecklingen av tester baserade på nukleinsyraförstärkningsteknik (NAAT) har varit den viktigaste utvecklingen inom chlamydialdiagnos sedan in vitro-cellodlingstekniker ersatte äggula för odling och isolering av organismen från kliniska prover. NAAT är minst 20-30 procent känsligare (kan detektera så lite som en enda genkopia) och 100 procent specifikt49,50. Det ger möjlighet att använda icke-invasiva prover som urin för att screena för infektioner hos asymptomatiska individer som vanligtvis inte skulle söka klinisk vård. Detta är en kritisk fördel, eftersom majoriteten av klamydiala infektioner hos kvinnor och en betydande del av infektioner hos män är asymptomatiska. Den mest kända av DNA-förstärkningsteknologierna är PCR. PCR kan vara släkt, art, grupp eller stamspecifik beroende på primerdesignen. Gener riktade för diagnos av C. trachomatis är MOMP-genen, den endogena plasmiden, fosfolipasgenen och 16S och 23s rRNA-genen. Eftersom alla nukleinsyraförstärkningstekniker upptäcker nukleinsyramål beror dessa inte på vare sig livskraft eller ett intakt tillstånd hos målorganismen för ett positivt resultat. Därför är transport av prov inte en kritisk fråga49. Även om det inte har studerats väl, verkar ”fönstret” för det kulturnegativa, PCR-positiva tillståndet efter behandling med doxycyklin vara upp till 3 wk29. Efter denna tid blir patientprover både kultur och PCR-negativa.

PCR-testet för detektion av C. trachomatis utvecklad av Roche Diagnostics, Basel Schweiz (Roche-Amplicor) var det första PCR-testet som godkändes av FDA i Usa51. Sedan 1993 har Amplicor PCR utvärderats relativt väl för både urogenitala och urinprover, med en total känslighet och specificitet på 90 och 99 till 100 procent, respektivt51. Amplicor PCR är godkänd för livmoderhalscancer, manliga urinrör och manliga urinprover.med explosionen av molekylärbiologiska tekniker nyare analyser som M2000-systemet (Abbott) samt strängförskjutningsförstärkning (SDA) (BD ProbeTec strandförskjutningsförstärkning utvecklad av Becton Dickinson och Company, Diagnostic Systems, Franklin Lakes, NJ) och transkriptionsmedierad förstärkning (TMA) (APTIMA-systemet av Gen-Probe, Inc., San Diego) blev tillgänglig för C. trachomatis. Även om de är populära i de utvecklade länderna, förhindrar deras höga initiala och underhållskostnader att de används i resursfattiga inställningar.

bördan av C. trachomatis-organismer i könsorganet (chlamydialbelastning) kan detekteras med kvantitativ realtids-PCR och kan variera från 10 till över en miljon organismer/ml könsorganssekretioner52. Detta kommer sannolikt att påverka prestandan hos olika nukleinsyraförstärkningstester, som inte rutinmässigt skiljer mellan personer med höga och låga klamydiala belastningar. Skillnader i chlamydial belastning har rapporterats vara förknippade med förekomsten av kliniska symtom, överförbarhet och persistens av infektion och risken för att utveckla kroniska följder53. Därför finns det en kritisk roll för kvantifiering vid diagnos och behandling av klamydiala infektioner.

NAATs är de mest känsliga testerna för screening och diagnos av klamydiala och gonokockinfektioner i könsorganet54,55,56. Tvivel om deras prestanda i områden med låg prevalens rapporteras57, 58. 2002 rekommenderade CDC att bekräfta alla positiva NAAT för C. trachomatis när testets positiva prediktiva värde är < 90 procent59. De verkliga egenskaperna hos NAAT-metoder visar sig dock vara >99 procent54,55.

CDC har också föreslagit flera möjliga strategier för bekräftelse59 som inkluderar (i) testa ett andra prov med en annan NAAT som har lika eller högre känslighet för det första testet, (ii) utföra en annan NAAT som har lika eller högre känslighet för det första testet som riktar sig mot en annan nukleinsyrasekvens på originalprovet, (iii) upprepa det ursprungliga testet på originalprovet och (iv) föra patienten tillbaka för en retest.begränsningar som beskrivs är dock att de flesta kliniker inte samlar in två prover för samma utvärdering, och det är inte heller möjligt att ta tillbaka patienten för att samla in ett annat prov, och de flesta laboratorier har inte faciliteter / förmåga att utföra två olika Naat.

begreppet bekräftande testning är inte nyt57. Det komplicerar dock hanteringen av ett NAAT-positivt prov och lägger till kostnad för ett redan dyrt screeningtest. Också, det finns fortfarande utrymme för att förbättra känsligheten hos NAATs, kanske genom bättre provberedning, automatisering, eller målkoncentration.

(ii) icke-specifika tester

Leukocytesteras (le) test är ett snabbt mätsticktest för användning med urinprover. Detta test är utformat för att detektera urinvägsinfektioner genom att detektera enzymet som produceras av polymorfonukleära (PMN) celler. Positiva LE-testresultat uppstår med infektioner orsakade av ett antal olika medel inklusive C. trachomatis och N. gonorrhoeae.

känsligheten hos le-testet för detektion av C. trachomatis-infektion varierar mycket från 31 till 100 procent och särdragen varierar från 83 till 100 procent60. LE-testet har ansetts vara det bästa screeningtestet för Ungdomar och bör enligt de flesta rapporter inte användas för att testa prover från Kvinnor eller äldre män på grund av otillfredsställande prestanda.

(iii) Rapid point of care (POC) tester

snabba tester, även kallade ”point-of-care” – tester för C. trachomatis använder MKB-teknik i format baserade främst på membranupptagning eller lateximmunodiffusion. Snabba tester utförs på läkarmottagningar, kräver inte sofistikerad utrustning och kan slutföras på cirka 30 minuter. Resultaten läses visuellt och är därmed kvalitativa. Även om flera Kit är kommersiellt tillgängliga, men ingen har utvärderats väl. I allmänhet är de snabba testerna betydligt mindre känsliga och specifika än Laboratorieutförda EIAs. Jämfört med PCR, känsligheten och specificiteten hos Clearview-testet (Unipath Ltd., Storbritannien) var 53,8 respektive 99,1 procent med endocervikala svabbprover och 31,1 och 95,2 procent med vaginala svabbprover från filippinska kvinnor61. De snabba testerna ger en fördel jämfört med konventionella laboratorietester endast när resultat krävs omedelbart för patienthantering. Snabbtest ska inte användas i en population med låg prevalens eller för asymptomatiska individer på grund av risken för falskt positiva resultat. Resultaten av ett snabbtest bör alltid betraktas som presumtiva och, om det är positivt, bör bekräftas genom ett laboratorieutfört test.

Sammanfattningsvis, även om kulturen är 100 procent specifik, kan dess uppskattade känslighet vara så låg som 50 procent. Majoriteten av laboratorierna har flyttat från kultur på grund av kostnader, tid och tekniska svårigheter. Således, i stället för kultur som en diagnostisk guldstandard, anses den utvidgade guldstandarden/definierade referensstandarden, dvs vanligtvis konsekvent resultat med två icke-kulturtekniker vara användbar som forskningsverktyg43.

(iv) serologi

de serologiska testerna är i allmänhet inte användbara vid diagnos av genitala infektioner orsakade av C. trachomatis. Antikroppar framkallade av C. trachomatis-infektion är långlivad och ett positivt antikroppstest kommer inte att skilja en tidigare från en aktuell infektion.