växtmaterial

observationer och kemiska analyser genomfördes från 2011 till 2018 på en samling av växter som odlas i den experimentella trädgården vid universitetet Louvain-la-Neuve campus (50 39’55’N; 4 37 ’11″e). Före och under deras blomningsperiod (juli–augusti) placerades växter i universitetets tillväxtkammare under kontrollerade förhållanden (24/22 C, 16 L:8D, RH 80 10%).

Insektsmaterial

de viktigaste insektsbesökararterna av A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum och B. terrestris) användes i försök med blommans attraktivitet och smakpreferens. A. mellifera och B. pascuorum individer (10 per test och behandling) samlades i naturen runt universitetsområdet (minst fyra platser per art) på morgonen före tester. Som B. terrestris individer kan inte lätt särskiljas i fältet (liknande morfologi för flera arter), vi använde humlor från fyra nässelfeber (Biobest, Westerloo, Belgien) placerade i närheten av universitetsbyggnaderna för att få individer för experiment.

blommiga egenskaper

pollenantal

ståndarna av 10 blommor vid manliga och kvinnliga faser samlades, räknades, torkades och placerades på en sikt (90 Crimson) som skulle gnidas för att samla pollenkorn. Mängden pollenkorn vägdes. Pollenantal utfördes vid Lille-1 University (Evo-Eco-Paleo Unit). Vi använde en partikelräknare för att uppskatta antalet pollenkorn i dessa prover. Dagen innan pollen räknas placerades prover i en rörvärmare tills det mesta av etanolen avdunstades. Vi tvingade sedan anther dehiscence genom att placera prover i en ugn vid 56 kg C över natten. Vi tillsatte 1 mL destillerat vatten till varje pollenprov. Rör sedan sonicated och vortexed att separera pollenkorn från ståndarknappar och varandra. Pollenlösning (200 CGL) späddes sedan i 5 mL isotonisk mätbuffert (Casy CGR ton). Partikelräknaren analyserade tre 400-ubicl-prover från pollensuspensionen, vilket gav totalt partikelantal i denna 1200 ubicl-volym, liksom räkningar för 400 storleksklasser som sträcker sig från 0,125 till 150 ubicm. Jämförelser med tomma prover gjorde det möjligt för oss att identifiera toppar av partiklar, med en storlek som sträcker sig från 20 till 30 kvm, vilket motsvarar pollenkorn. Antalet pollenkorn per anther uppskattades genom att multiplicera värdena som tillhandahålls av partikelräknaren med utspädningsförhållandet (dvs. (1000/200) × (5000 + 200)/1200).

blomfärg och morfologi

vi mätte blommiga egenskaper (corolla längd, corolla diameter, blommig färg och UV-reflektans) på 10 blommor per fas (från 10 olika individer). Hjälmbredd, corolla längd och diameter mättes med en calliper. Vi mätte tepal färgreflektionsspektrum med en fiberoptisk spektrometer (Avaspec-ULS2048) och en xenonpulserad ljuskälla (Avaljus-XE, Avantes, Apeldoorn, Nederländerna). För UV-reflektansmätningar fixades blommor på en svart bakgrund och fotograferades med en Nikon D40 (Coastal Optical 60 mm 1:4 UV-VIS-IR ApoMacro; Filter X-Nite 330).

blommig Flyktig samling

vi samplade flyktiga organiska föreningar (voc) från intakta manliga och kvinnliga fasblommor (N = 4 för varje fas). Varje blomma infördes individuellt i en glödlampa (50 mm längd och 30 mm diameter), med en öppning på 17 mm. För att förhindra luftförorening var ett Teflonrör fyllt med aktivt kol anslutet till ena änden av glaslampan och två glas tenax TA-rör (6 mm 4 mm, 7 tum; 60-80 mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, belgien) var anslutna till den andra änden. Tenax-rören var anslutna till kalibrerade luftpumpar (Gilair plus, Sensidyn, St Petersburg, USA) med en flödeshastighet på 50 mL·min−1 i 180 min (mellan 11:00 och 14:00 h). Laboratorieförhållandena varierade mellan 21,5 och 23,5 c c med 45 till 55% RH.

fångade voc: er desorberades sedan termiskt på en Agilent 6800 gaskromatograf utrustad med en Gerstel TDU−termodesorptionsenhet och CIS-kryokylare bibehållen vid -50 CCC.omedelbart efter termodesorption programmerades CIS-enheten t CCB från -50 CCB till 300 CCB vid 12 ccbc1. GLC-apparaten kopplades till en Agilent 7975 C masspektrometer. Analytiska förhållanden var följande: delad injektion (med delat förhållande 50: 1, helium vid 1,6 mL min−1 som bärargas), VF-Max MS 30 m x 250 Crimson (df = 0,25 Crimson) kolonn (Agilent). Temperaturen program som gör det bäst separation (preliminära tester som inte visas) fastställdes enligt följande: 40 °C (5 min) då till 75 °C vid 4 °C min−1 och till 115 °C (3 °C min−1) och slutligen till 250 °C till 13 °C min−1. MS-villkoren var följande: Ei-läge vid 70 eV, källa t Kubi = 250 C C, MS quadrupole vid 200 C C och skannat massintervall 35 till 500 amu.

de inspelade kromatogrammen tolkades systematiskt för att söka efter VOC som är specifika för manliga eller kvinnliga faser. När de upptäcktes identifierades molekylerna enligt beräknade databaser (Wiley 250.L och PAL 600). Identifieringarna bekräftades baserat på retentionsdata för rena molekyler kommersiellt tillgängliga. De kvantifierades också i förhållande till mycket ren intern standard (limonen, 1 occl metanol lösning vid 0.67 cyrg cyrl1 läggs automatiskt till varje desorptionsrör före termisk process).

omgivande luft samlades också in som en kontroll för att identifiera bakgrundsföroreningar. För att förhindra ett eventuellt genombrott placerades systematiskt en andra glaspatron laddad med samma adsorbent (Tenax TA) i tandem. Analysen avslöjade inga spår av molekylerna av intresse.

Alkaloid samling och analyser

ståndarknappar uppsamlades från 50 blommor (från 10 individer), torkades och krossades sedan på en sikt (90 CGR) för att samla pollenkorn. Tre replikat av 15 mg pollen samplades för alkaloider. Proverna frystes (-80 C. C.) I 2 timmar och frystorkades därefter. Torra prover maldes till ett fint pulver med flytande kväve och vägda mängder pulver placerades i ett 1,5 mL mikrocentrifugrör (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Alkaloider extraherades med användning av en vävnadshomogenisator (VWR Ultrasonic Cleaner) i 10 min i 100 CGL extraktionsbuffert (70% vattenhaltig metanol och 0,5% myrsyra). Efter centrifugering vid 12 000 rpm i 5 min (centrifug 5430 r) överfördes supernatanten till ett 1,5 mL mikrocentrifugrör. Efter torkning i en SpeedVac, alkaloider återsuspenderades i 200 CGL av LC-MS-klass metanol och filtrerades med en 0,45-CGM PTFE sprutfilter (Whatman).

nektar uppsamlades i 5-UKG glaskapillärrör (Hirschmann Laborger Uikte, Eberstadt, Tyskland) från 50 blommor (från 10 individer). Tre replikat av 15 CGR nektar torkades i en SpeedVac och resuspenderades i 200 CGR LC-MS-klass metanol före filtrering med ett 0,45-CGR PTFE sprutfilter (Whatman).kemiska analyser utfördes med användning av ett LC-MS/MS-system bestående av en Thermo Accela pump, autosampler, fotodiod array detektor och en Thermo Scientific LTQ orbitrap XL massdetektor (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Woluwe, Belgien). En Phenomenex Gemini C18-kolonn användes(2 mm 150 mm, packad med 3-partiklar). Ett binärt lösningsmedelssystem med en flödeshastighet på 300 sekl min−1 användes: lösningsmedel a, HPLC-vatten (0,1% myrsyra); och lösningsmedel B, LC-MS-metanol (0 min: 95% a, 10-12 min: 0% a, 13-17 min: 95% a). En volym på 10-sekgl injicerades och kolonntemperaturen ställdes in till 30 C. MS med hög upplösning utfördes med en elektrosprayjoniseringskälla i positivt läge. Följande inloppsbetingelser tillämpades: kapillärtemperatur, 275 ci C; kapillärspänning, 13 V; rörlins, 140 V; mantelgasflöde, 30 a.u.; och extra gasflöde, 10 u.a. datainsamling och bearbetning utfördes med Xcalibur-programvara. Denna metod omfattade massområdet för alla alkaloider (MW från 329 till 673). Alkaloider från pollen och nektar upptäcktes och identifierades preliminärt av högupplöst MS. Fragmentering erhållen genom kollisionsinducerad dissociation hjälpte till vid identifieringen. Alkaloid koncentrationer beräknades baserat på en akonitin standardkurva i MeOH och uttrycktes som ”akonitin-ekvivalent”. Analyserade alkaloider valdes baserat på deras närvaro i andra Aconitum-arter4,8.

nektarproduktion och sockerkomposition

nektar uppsamlades i 5-sekl glaskapillärrör (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Tyskland) från blommor av växterna som överfördes i tillväxtkamrarna på universitetsområdet (inga insektsbesök). Vi uppskattade nektarproduktionstrenden under dagen i början av anthesen genom att prova 2 blommor från 12 individer var 2: e timme under 10 timmar. Vi mätte också den totala nektarproduktionen per blomma (2 blommor från 12 individer) för samma blommor var 2: e dag under hela (9 dagar) blommans livslängd, vid samma tid varje dag, 2 timmar efter att ljuset tändes. Total produktion för manliga och kvinnliga faser beräknades från provtagning i slutet av manliga (5 dagar efter anthesis) och kvinnliga (8 dagar) faser.

Nektarprover lagrades vid -80 CCG tills kemiska analyser utfördes. Efter derivation utfördes sockeridentifiering och kvantifiering av GC-MS (Thermo Trace 1310 /Thermo ISQ-QD). En Restek Rxi-5Sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 ubicm df) kolonn användes. Flödeshastigheten var 1,0 mL min – 1 (helium). De injicerade delningsförhållandena var 1/10 för hexoserna och 1/100 för sackaros. Följande inloppsbetingelser tillämpades: ugnstemperatur, 105 ci C i 4 min, sedan till 280 C C vid 15 ci c min−1 (i 20 min) och injektortemperatur på 250 C.Den totala sockerhalten i nektar per blomma (mg) beräknades sedan som volym nektar (UCL) x total sockerkoncentration (mg/UCL).

Insektsbeteende

under 2011 och 2012 genomfördes undersökningar i de fyra återstående naturliga populationerna i fenor i södra Belgien. Av dessa innehåller naturreservatet ”Les Abattis”(49 80’50’N, 5 32 ’59″e, 399″ e) den största och tätaste befolkningen (2970 m2 med 1330 1030 A. napellusblommor m−2). Vid ” Fouches ”(49 oz 4’8” n; 5 oz 43’06″E), som har den näst största befolkningen (1788 m2), individer av A. napellus var mycket utspridda över området och vid mycket lägre densiteter (176 177 blommor m−2) ”Chantemelle’ (49 39 37″N; 5 39 37″E) hade en diskontinuerlig befolkning bestående av tre fläckar (161, 423 och 500 m2) med relativt låga växt−och blomdensiteter (179 125 blommor m-2). ”Sainte-Marie”(49 20’06’N, 5 32 ’56″E) hade en liten och ojämn befolkning (292 m2, 152 163 blommor m−2) som sträckte sig cirka 150 m längs ett tidigare järnvägsspår.

Blombesökare registrerades i 10-min observationer under toppblomning på tre på varandra följande dagar 2011 (mellan 30 augusti och 3 September) och på fyra dagar 2012 (mellan 21 och 27 augusti) med torra och varma väderförhållanden. Andelen manliga fasblommor, under dessa dagar och i alla populationer, var högre än kvinnliga fasblommor (cirka 85%). Blommor inom 1 m2 (eller cirka fem växter) observerades samtidigt. Minst tio observationer per population genomfördes (högst 16), spridda över hela populationerna och över olika tider under dagen. För varje besökare registrerade vi arten, antalet rånade och obefogade blommor som besökts per växt och lapp, tid per enskild blomma samt deras foderbeteende (pollen-eller nektaruppsamling, legitimt eller olagligt besök, kallat rån (basarbete, primär och sekundär rån). Under 530 min blomobservationer 2011 och 400 min 2012 registrerade vi 183 blombesökare. Humlor (B. pascuorum och B. hortorum) och honungsbin (Apis mellifera) var de stora blombesökarna; endast 3 B. terrestris individer observerades.

pollenbärande kapacitet

trettio individer per art dödades med etylacetat och individuellt lager. Pollen avlägsnades från de olika insektsdelarna med små kuber gelatin-glycerin53. Pollenkorn koncentrerade i corbicula avlägsnades och ingick inte i analyser. Alla pollenkornen räknades med ljusmikroskopi.

pollenuppsamlingsrenhet

vi samplade pollenbelastningar från humlor som besöker A. napellus i de naturliga populationerna. I labbet acetolyserades pollenbelastningar53. Minst 400 slumpmässigt utvalda pollenkorn av var och en av de 25 pollenbelastningarna identifierades och räknades under ljusmikroskopi.

gustatoriska svar från insektsbesökare

vi följde protokollet från Ma et al.54 för detektion av akonitin. När de fångades svältades enskilda bin i 3 timmar i en plastflaska (7 cm lång, 2,8 cm innerdiameter) vid rumstemperatur och i fullständigt mörker i labbet. Vi överförde varje bi till ett hållrör, ett 15 mL centrifugrör med ett 4 mm hål borrat vid spetsen och ett stycke stålnät fixerat inuti. Efter en förtestfas med en droppe sackaros presenterade vi testlösningen i ett kapillärrör av 100-sekl glas och pressade försiktigt slangen för att bibehålla lösningen vid rörets spets. Varje insekt utan proboscis förlängning efter 5 minuter avlägsnades från testet. Testfaserna var 2 minuter långa och volymen av lösningen före och efter testet registrerades med en kalliper.

tester utfördes med tre besökararter (A. mellifera, B. pascuorum och B. terrestris). Tio individer per insektsarter testades med varje lösning. Koncentrationer av sackaros (430 mikrogram mg−1) och akonitin (232 mikrogram g−1) motsvarade de som finns i vår art. Tre lösningar presenterades: avjoniserat vatten ensamt (kontroll), ren sackaroslösning och sackaros plus akonitinlösning.

För alla tester beräknades ett avskräckningsindex för varje ämne från valet att dricka, volymen av lösningen som konsumeras och tiden för kontakt med lösningen enligt följande: ID = 1 – (val för sackaros/val för sackaros + akonitin) (volym förbrukad av sackaros/volym förbrukad av sackaros + akonitin) (tid för kontakt med sackaroslösning/tid för kontakt med sackaros + akonitinlösning).

statistiska analyser

dataens normalitet uppskattades med hjälp av Shapiro–Wilk-tester och homoscedasticitet verifierades med hjälp av Levenes tester. När normalitet och homoscedasticitetskrav uppfylldes utfördes analyser av varians (ANOVAs) (blomfaseffekt på blommiga flyktiga ämnen). I annat fall utfördes icke-parametriska tester med Wilcoxon-test för jämförelse av två tillstånd (blomfaseffekt på blommorfologi och nektarparametrar) och Kruskall-Wallis-test för jämförelse av mer än två tillstånd (insekts-och lösningseffekt på konsumerad volym och kontaktvaraktighet med lösningen i gustatoriska experiment, insektseffekt på besöksbeteendet) och chi-kvadrattester utfördes för att jämföra procentandelarna av individer i gustatoriska experiment. ANOVA och icke parametriska analyser följdes av multiparvis jämförelse när mer än två villkor jämfördes. Alla analyser genomfördes i SAS Enterprise Guide 7.1. Uppgifterna presenteras som medel för standardavvikelser i form av en standard.