utföra HPLC

introduktion

högpresterande vätskekromatografi är i grunden en mycket förbättrad form av kolonnkromatografi. Istället för att ett lösningsmedel får droppa genom en kolonn under tyngdkraften, tvingas det genom under höga tryck på upp till 400 atmosfärer. Det gör det mycket snabbare.

det låter dig också använda en mycket mindre partikelstorlek för kolonnförpackningsmaterialet vilket ger en mycket större yta för interaktioner mellan den stationära fasen och molekylerna som flyter förbi den. Detta möjliggör en mycket bättre separation av komponenterna i blandningen.

den andra stora förbättringen jämfört med kolonnkromatografi gäller detektionsmetoder som kan användas. Dessa metoder är mycket automatiserade och extremt känsliga.

kolumnen och lösningsmedlet

förvirrande finns det två varianter som används i HPLC beroende på lösningsmedlets relativa polaritet och den stationära fasen.

Normal fas HPLC

detta är i huvudsak precis samma som du redan har läst om i tunnskiktskromatografi eller kolonnkromatografi. Även om det beskrivs som ”normalt” är det inte den vanligaste formen av HPLC.

kolonnen är fylld med små kiseldioxidpartiklar, och lösningsmedlet är till exempel icke-polärt hexan. En typisk kolonn har en inre diameter på 4,6 mm (och kan vara mindre än den) och en längd på 150 till 250 mm.

polära föreningar i blandningen som passerar genom kolonnen kommer att hålla sig längre till polär kiseldioxid än icke-polära föreningar kommer att göra. De icke-polära kommer därför att passera snabbare genom kolumnen.

omvänd fas HPLC

i detta fall är kolonnstorleken densamma, men kiseldioxiden modifieras för att göra den icke-polär genom att fästa långa kolvätekedjor på dess yta – vanligtvis med antingen 8 eller 18 kolatomer i dem. Ett polärt lösningsmedel används-till exempel en blandning av vatten och en alkohol såsom metanol.

i detta fall kommer det att finnas en stark attraktion mellan det polära lösningsmedlet och polära molekyler i blandningen som passerar genom kolonnen. Det kommer inte att finnas så mycket attraktion mellan kolvätekedjorna fästa vid kiseldioxiden (den stationära fasen) och de polära molekylerna i lösningen. Polära molekyler i blandningen kommer därför att spendera större delen av sin tid på att röra sig med lösningsmedlet.icke-polära föreningar i blandningen tenderar att bilda attraktioner med kolvätegrupperna på grund av van der Waals dispersionskrafter. De kommer också att vara mindre lösliga i lösningsmedlet på grund av behovet av att bryta vätebindningar när de klämmer in mellan exempelvis vatten-eller metanolmolekylerna. De spenderar därför mindre tid i lösning i lösningsmedlet och detta kommer att sakta ner dem på väg genom kolonnen.

det betyder att det nu är de polära molekylerna som kommer att färdas genom kolonnen snabbare.

omvänd fas HPLC är den vanligaste formen av HPLC.