GDF11PRO-Fc binder till både GDF11 och MSTN

för att visa att GDF11PRO-Fc kan binda den aktiva mogna GDF11 dimer via en direkt interaktion syftade vi till att identifiera en protein-protein interaktion mellan GDF11 och gdf11pro-FC. Dessutom, på grund av den nära strukturella homologin hos GDF11 och mstn mogna dimerer, ville vi också avgöra om GDF11PRO-Fc associerar med MSTN. För att identifiera dessa protein-protein-interaktioner utförde vi en uppsättning neddragningsanalyser (Fig. 1). Liganderna rGDF11, rMSTN och rActivin a inkuberades med lysatfraktioner från HEK293-celler transfekterade med en plasmidkodning för GDF11PRO-Fc eller MPRO-Fc vid pH 7.4. På grund av de konjugerade Fc-fragmenten på de modifierade propeptiderna kunde fraktioner dras ner direkt på ett protein A/G agarosharts. Som förväntat drog GDF11PRO-Fc effektivt ner både rGDF11 och rMSTN, vilket indikerar att GDF11PRO-Fc kunde binda båda liganderna. Dessutom drog MPRO-Fc framgångsrikt ner både rGDF11 och rMSTN också. Både GDF11PRO-Fc och MPRO-Fc kunde inte dra ner den mer avlägset besläktade TGF-Kubi superfamiljen ligand rActivin A, vilket indikerar att ligandbindningen är specifik (Fig. 1). Ingen bindning av GDF11PRO-Fc, MPRO-Fc, rGDF11, rMSTN eller rActivin A observerades på ett kontrollagarosharts utan protein A/G. Från dessa resultat drar vi slutsatsen att GDF11PRO-Fc spontant associerar med de mogna GDF11-och MSTN-dimererna vid fysiologiskt pH.

GDF11PRO-Fc associerar med GDF11 och MSTN. Protein-protein interaktioner mellan GDF11PRO-Fc eller MPRO-Fc och rGDF11, rMSTN eller rActivin A bestämdes genom en neddragningsanalys. GDF11PRO-Fc eller MPRO-Fc inkuberades med rGDF11, rMSTN eller rActivin A i 1 timme vid 4 C. Fc-smält proteinkomplex separerades på ett protein a/G-belagt agarosharts och eluater kördes på en 12% SDS-sidig gel under reducerande förhållanden och undersöktes av western blot. Ingångskontroll var 5% av ingångsmaterialet. WB western blot

GDF11PRO-Fc blockerar GDF11/Mstn-inducerad atrofi i c2c12 myotubes

tillsats av rGDF11 och rMSTN till differentierade myotubes har tidigare visat sig inducera atrofi i murina C2C12 och primära humana skelett MYOTUBES . Efter att ha bestämt att GDF11PRO-Fc binder GDF11 och MSTN, frågade vi nästa om GDF11PRO-Fc kunde förhindra GDF11/MSTN-inducerad myotube atrofi i differentierade c2c12 myotubes. För att uppnå detta förpackade vi DNA-sekvenskodningen för GDF11PRO-Fc i aav6-kapsiden för att generera aav6-GDF11PRO-Fc-vektorn. I dessa experiment valdes aav6-vektorn för sin förmåga att effektivt och selektivt omvandla differentierade c2c12-myotubes, men inte myoblaster . C2c12 myoblaster odlades och differentierades i 5 dagar före behandling med AAV6-GDF11PRO-Fc eller aav6-EGFP (kontrollvektor) vid en MOI på 105 (Fig. 2a). Som förväntat var GFP-uttryck observerbart i c2c12 myotubes infekterade med AAV6-EGFP vid 48-72 h efter infektion, och kvantifiering av internaliserade vektorgenomkopior per diploid genom vid 72 h efter infektion indikerade att vektortransduktion uppnåddes tillräckligt (Fig. 2b och c).

GDF11PRO-Fc blockerar GDF11/MSTN-inducerad myotube-atrofi i c2c12-celler. en schematisk detailing experimentell tidslinje i C2C12 myotubes. AAV6-EGFP eller AAV6-GDF11PRO-Fc tillsattes till c2c12 myotubes vid en MOI på 105 på dag 5 Efter differentiering och 100 ng/ml rGDF11 eller rMSTN tillsattes på dag 7. Myotubes färgades och analyserades på dag 10. B EGFP-uttryck var uppenbart vid 48-72 h i C2C12 myotubes behandlade med AAV6-EGFP (MOI 10 ). Skala staplar representerar 50 kubm. C Vektorgenom kopieringsnummer per diploid genom i C2C12 myotubes 72 h efter tillsats av AAV6-EGFP eller AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10 ). D representativa immunofluorescensbilder av c2c12 myotubes. C2c12 myotube-membran visualiserades genom färgning med en anti-dystrofinantikropp (röd). Kärnor färgades med DAPI (blå). Infälld visar en inzoomad region. Skala staplar representerar 50 ozonm (huvudpanelen) och 25 ozonm (Panel infälld). e fraktionen av kärnor införlivade i myotubes (differentieringsindex) beräknades och presenterades som en procentandel av kontrollen. f Genomsnittlig myotube diameter i förhållande till kontroll och (g) fördelning av diametermätningar. För mätningar av myotube-diameter mättes varje myotube vid tre punkter längs myotubeens längd och i genomsnitt. h antal kärnor införlivade per myotube. Minst 50 myotubes analyserades per experimentellt tillstånd. i pSMAD2 / 3 i förhållande till tSMAD2/3 bedömdes av western blot. Lika proteinbelastning verifierades genom Ponceau s-färgning och GAPDH användes som lastkontroll. Data representerar resultat från tre separata experiment. Alla felfält representerar medelvärdet av en sem-sem. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Sjuttiotvå timmar senare fixerades och färgades myotubes för immunofluorescensanalys med användning av en antikropp som känner igen dystrofin (rod 22/rod 23) för att visualisera myotube perifera membran och DAPI för att fläcka myonuklei (Fig. 2d). En minskning av differentieringsindexet, som definieras som andelen myonuklei införlivad i myotubes, observerades i myotubes behandlade med rGDF11 (− 15%, p = 0,0008) eller rMSTN (− 14%, p = 0,0013) i förhållande till obehandlad kontroll. Denna effekt avtrubbades emellertid i GDF11PRO-Fc-Uttryckande C2C12 myotubes behandlade med rGDF11 (- 1,9%; p = 0.0047, jämfört med rgdf11-behandlad kontroll) eller rMSTN (− 3,0%; p = 0,0040, jämfört med rmstn-behandlad kontroll; Fig. 2e). Dessutom motstod c2c12 myotubes som behandlades med AAV6-GDF11PRO-Fc rgdf11 eller rMSTN-inducerad myotube atrofi. En signifikant minskning av den genomsnittliga myotubediametern i förhållande till kontroll detekterades i myotubes behandlade med rGDF11 (− 39%; 0,0002) eller rMSTN (− 35%; p = 0,0003) jämfört med kontroll. Tvärtom, myotubes som uttrycker GDF11PRO-Fc behandlad med rGDF11 (- 1, 8%; p = 0, 0005, jämfört med rgdf11− behandlad kontroll) eller rMSTN (- 5, 3%; p = 0.0075, jämfört med rmstn-behandlad kontroll) påverkades till stor del inte (Fig. 2f och g). I ett separat experiment kunde GDF11PRO-Fc inte förhindra rActivin a-inducerad myotube-atrofi, vilket är i linje med observationen att GDF11PRO-Fc inte binder activin A (ytterligare fil 1: figur S3).

behandling med rGDF11 eller rMSTN var också associerad med en lägre andel mogna myotubes med högre antal myonuklei, vilket antyder en hämning av myotube-differentiering. Myotubes med mer än 11 myonuclei omfattade endast 5,2% (p = 0,0215) och 7,2% (p = 0.0328) av myotubes analyserade i celler behandlade med rgdf11 respektive rMSTN. I jämförelse utgjorde myotubes med mer än 11 kärnor 26% av myotubes analyserade i kontrollmyotubes. I myotubes som uttryckte GDF11PRO-Fc som behandlades med rGDF11 eller rMSTN var andelen myotubes med mer än 11 myonuklei 22% (p = 0, 0104, jämfört med rgdf11-behandlad kontroll) respektive 19% (p = 0, 0404, jämfört med rMSTN-behandlad kontroll) (Fig. 2h). Slutligen, i överensstämmelse med vad som skulle förväntas efter GDF11/MSTN-signalering vid ActRII, observerades en ökning av fosforylerade SMAD2/3 (pSMAD2/3) proteinnivåer i myotubes behandlade med aav6-EGFP och rGDF11 eller rMSTN på western blot 24 h efter tillsats av ligand (Fig. 2i). Denna ökning av psmad2/3-nivåer var frånvarande i myotubes behandlade med Aav6-GDF11PRO-Fc, vilket tyder på att GDF11PRO-Fc-uttryck motverkar GDF11/MSTN-inducerad aktivering av SMAD2 / 3 i differentierade myotubes. Sammantaget indikerar dessa resultat att GDF11PRO-Fc kunde förhindra rgdf11 och rMSTN-inducerad myotubeatrofi och hämning av differentiering i c2c12-celler.

lokaliserat GDF11PRO-Fc-uttryck inducerar skelettmuskelhypertrofi hos vuxna möss

tidigare har vi visat att systemisk AAV-vektormedierad genleverans av GDF11PRO-Fc till neonatala möss ledde till en signifikant ökning av graden av skelettmuskeltillväxt . Det var emellertid oklart från denna studie huruvida GDF11PRO-Fc helt enkelt förbättrade skelettmuskeltillväxten eller faktiskt inducerade skelettmuskelhypertrofi. Vidare var det inte möjligt att avgöra om effekterna av GDF11PRO-Fc medierades av lokal blockad av GDF11/MSTN i skelettmuskulaturen eller om de observerade effekterna berodde på systemisk modulering av GDF11/MSTN. För att ta itu med dessa frågor utvärderade vi effekten av intramuskulär aav9-GDF11PRO-Fc-administrering hos vuxna C57BL/6J-möss. I dessa studier injicerades endast höger bakben och den kontralaterala vänster bakben användes som kontroll.

kroppsvikt ökade något över tiden hos möss behandlade med aav9-GDF11PRO-Fc (+10% vid 10 veckor; p = 0,0418; Fig. 3a). Dessutom ökade greppstyrkan med en bakben normaliserad till kroppsvikt signifikant i båda lemmarna som testades individuellt, med större effekt som ses i den behandlade högra bakbenen (+ 37%; p = 0,0177), även om en signifikant ökning av normaliserad greppstyrka i den obehandlade vänstra bakbenen (+ 18%; p = 0,0426) också observerades. Denna skillnad nådde emellertid inte betydelse när båda bakbenen testades samtidigt (+15%; p = 0,2375; Fig. 3b). Tio veckor efter vektoradministration var den högra bakbenen synligt större hos möss behandlade med AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3c). Hos möss behandlade med AAV9-GDF11PRO-Fc var den våta vävnadsmassan hos den injicerade högra tibialis anterior (+50%; p = 0,0046) och gastrocnemius (+37%; p = 0,0023) signifikant högre jämfört med fordonsbehandlade kontroller. Det fanns ingen statistiskt signifikant skillnad i den våta vävnadsmassan hos de obehandlade vänstra bakbensmusklerna (Fig. 3d). Myofiberområdesanalys avslöjade en ökning av det genomsnittliga myofibertvärsnittsarean (+ 15%; p = 0.0078) i aav9-GDF11PRO-Fc-injicerad höger gastrocnemius (Fig. 3e och f). MFD-distributionsanalys avslöjade också en förskjutning mot större myofibrer i höger sida gastrocnemius av möss injicerade med AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3G), vilket indikerar att lokaliserad GDF11PRO-Fc-uttryck inducerade muskelhypertrofi. I en separat kohort bedömde vi också effekten av lokaliserad genleverans av GDF11 genom en intramuskulär injektion av AAV9-GDF11 i höger bakben och signifikant muskelatrofi observerades 10 veckor efter behandlingen i den injicerade bakbenen (ytterligare fil 1: figur S4).

GDF11PRO-Fc inducerar lokaliserad skelettmuskelhypertrofi efter intramuskulär genleverans. 8 veckor gamla C57BL / 6J-möss behandlades med AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 5) eller vehikel (n = 5) via ensidig intramuskulär injektion i höger bakben. Den kontralaterala vänstra bakbenen behandlades inte. Möss euthaniserades 10 veckor efter behandlingen. en genomsnittlig kroppsvikt över tiden. B Hindlimb greppstyrka normaliserades till kroppsvikt vid 10 veckor efter behandlingen. Visas är mätningar från en enda bakben och båda bakbenen. C representativ brutto baklimb muskulatur. Den injicerade bakbenen betecknas med en svart pil. D våt vävnadsvikt av tibialis anterior och gastrocnemius. e representativa immunofluorescensbilder av injicerade gastrocnemius tvärsnitt på höger sida färgade med AlexaFluor-488-konjugerad WGA för att visualisera myofibrer. Skala staplar representerar 100 kubm. f Genomsnittlig myofiber tvärsnittsarea i den injicerade högra sidan gastrocnemius. g myofiber MFD distribution i den injicerade högra sidan gastrocnemius. Minst 500 myofibrer mättes per mus. h Western blot identifiering av GDF11PRO-Fc i vävnadslysater från injicerade högra gastrocnemius och leverprover av behandlade möss. GDF11PRO-Fc kunde inte detekteras hos fordonsbehandlade möss. Lika proteinbelastning verifierades genom Ponceau s-färgning och GAPDH användes som lastkontroll. Alla felfält representerar medelvärdet av en sem-sem. * p <0,05; **p < 0,01; n.s. inte signifikant; jämfört med fordonsbehandlad kontroll. Ta tibialis anterior, Gas gastrocnemius

Western blot-analys indikerade att GDF11PRO-Fc-proteinet uttrycktes i aav9-GDF11PRO-Fc-injicerat höger gastrocnemius (58 kDa-band; Fig. 3h). GDF11PRO-Fc kunde emellertid inte detekteras i den obehandlade vänstra gastrocnemius vid samma totala proteinmängd laddad, vilket tyder på att majoriteten av skelettmuskulaturen GDF11PRO-Fc-uttrycket var lokaliserat till den injicerade högra bakbenen (data visas inte). GDF11PRO-Fc kunde också detekteras i levern av western blot vilket indikerar att viss systemisk exponering hade inträffat (Fig. 3h). Denna observation kan sannolikt hänföras till kärlläckage av aav9-vektorn i systemisk cirkulation från injektionsstället . Från dessa data bestämmer vi att GDF11PRO-Fc inducerar skelettmuskelhypertrofi hos vuxna möss. Dessutom medieras dessa effekter åtminstone delvis av lokal blockad av GDF11 / MSTN på skelettmuskel, troligen via hämning av ligandinteraktioner med ActRII på skelettmuskelvävnad.

systemisk GDF11PRO-Fc genleverans ökar skelettmuskelmassan och styrkan hos mdx-möss

därefter utvärderade vi effekten av systemiskt GDF11PRO-Fc-uttryck i mdx-möss för att avgöra om GDF11PRO-Fc också kan inducera hypertrofi och öka styrkan i dystrofisk skelettmuskel. I denna studie modifierades GDF11PRO-Fc-konstruktionen med en mutation för att göra den ogenomtränglig för endogen bmp1/TLD-liknande metalloproteinas klyvning (GDF11PRO-Fc D122A) och öka faktorens persistens i systemcirkulationen . För dessa experiment utvärderades både AAV9-GDF11PRO-Fc och aav9-GDF11PRO-Fc D122A för att fastställa om den muterade d122a-transgenen skulle leda till en mer uttalad effekt in vivo. För att uppnå systemiskt uttryck behandlades mdx-möss med vektor eller vehikel genom injektion av svansven. Efter intravenös leverans omvandlar aav9-vektorn muslever med hög effektivitet. Transducerade hepatocyter kan sedan uttrycka transgenen och utsöndra proteinprodukten i systemisk cirkulation .

Från och med 3 veckor efter injektionen observerade vi en signifikant ökning av kroppsvikt som kvarstod under prövningens varaktighet med aav9-GDF11PRO-Fc (+ 7, 7% vid 12 veckor; p = 0, 0094) och aav9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 11% vid 12 veckor; p = 0, 006) behandling (Fig. 4a). Det bör noteras att på grund av den dystrofa patologin uppvisar mdx-möss typiskt kompensatorisk muskelhypertrofi, vilket delvis kan maskera ökningen av muskelmassa inducerad av GDF11PRO-Fc-uttryck. När det gäller muskelfunktionstester visade behandlade möss ökad grepp i frambenet, även efter normalisering till kroppsvikt. Skillnaden i normaliserad frambengrepp styrka nådde emellertid endast statistisk signifikans i aav9-GDF11PRO-Fc D122A-gruppen. Vid 12 veckor efter behandlingen ökade den genomsnittliga normaliserade greppstyrkan för framben med + 28% (p = 0,0873) respektive + 36% (p = 0,0248) hos möss behandlade med AAV9-GDF11PRO-Fc respektive AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (Fig. 4b). Rotarods prestanda förbättrades också genom aav9-GDF11PRO-Fc D122A-behandling i genomsnitt (+93% ökning av rotarods latenstid; p = 0,0127). Rotarods prestanda förbättrades också i aav9-GDF11PRO-Fc-Gruppen, men denna skillnad nådde inte statistisk signifikans (+ 44% ökning av rotarods latenstid; p = 0,2835; Fig. 4c). Det fanns ingen skillnad observerades i löpband löptid över någon av grupperna (Fig. 4d).

GDF11PRO-Fc förbättrar greppstyrkan och rotarodprestanda i dystrofa mdx-möss. 6 veckor gamla mdx-möss behandlades med aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) eller vehikel (n = 7) via svansveninjektion. en genomsnittlig kroppsvikt över tiden. B frambenets greppstyrka normaliseras till kroppsvikt över tiden. C bästa rotarodtid till fall registrerad från förbehandling (baslinje) och 12 veckor efter behandlingen. Den bästa tiden från tre försök användes för analys. D Total distanskörning på löpbandsuthållighetstest från förbehandling (baslinje) och 12 veckor efter behandlingen. Alla felfält representerar medelvärdet av en sem-sem. *p < 0,05; **p < 0,01; n.s. inte signifikant; jämfört med fordonsbehandlad kontroll

i slutet av 12-vecka försök, muskelhypertrofi var grovt tydligt i de behandlade mössen (Fig. 5a). Genomsnittliga våtvävnadsmassor av tibialis anterior, gastrocnemius och quadriceps ökade med + 17% (p = 0,0472), + 20% (p = 0,0011) och + 14% (p = 0.0333), respektive i aav9-GDF11PRO-Fc-Gruppen. I aav9-GDF11PRO-Fc D122A-gruppen ökades dessa värden ytterligare till + 26% (p = 0,0030), + 31% (p = 0,0003) och + 23% (p = 0,0009) över fordonsbehandlad kontroll för förändringen i genomsnittlig tibialis främre massa, gastrocnemius massa respektive quadriceps massa. Dessutom ökade membranvävnadsmassan med + 19% (p = 0,0162) respektive + 26% (p = 0,0014) i grupperna AAV9-GDF11PRO-Fc respektive aav9-GDF11PRO-Fc D122A. Intressant var hjärtmassan inte signifikant förändrad genom behandling. Den genomsnittliga gastrocnemius myofiber tvärsnittsarean var högre hos möss behandlade med AAV9-GDF11PRO-Fc (+23%; p = 0,0226) och Aav9-GDF11PRO-Fc D122A (+25%; p = 0,0170; Fig. 5c och d). I MFD-distributionsanalysen tenderade MFD att toppa runt 20-30 cdr över alla grupper, vilket sannolikt beror på den högre andelen små regenererande myofibrer i dystrofisk muskel. Behandling med AAV9-GDF11PRO-Fc och AAV9-GDF11PRO-Fc D122A resulterade emellertid i en ökad andel myofibrer med MFD högre än 64 cdr, vilket tyder på att faktoruttryck hade inducerat myofiberhypertrofi (Fig. 5e) i skelettmuskulaturen.

GDF11PRO-Fc inducerar skelettmuskelhypertrofi hos dystrofa mdx-möss. 6 veckor gamla mdx-möss behandlades med aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) eller vehikel (n = 7) via svansveninjektion. Möss euthaniserades 12 veckor efter behandlingen. en representativ grov baklimb muskulatur. B våt vävnadsvikt av lemmuskler, membran och hjärta. C representativa immunofluorescensbilder av gastrocnemius tvärsnitt färgade med AlexaFluor-488-konjugerad WGA för att visualisera myofibrer. Skala staplar representerar 100 kubm. D Genomsnittlig myofiber tvärsnitt område i gastrocnemius. e Myofiber MFD distribution i gastrocnemius. Minst 500 myofibrer mättes per mus. f identifiering av GDF11PRO-Fc av western blot i levervävnadslysat och serum hos möss behandlade med AAV9-GDF11PRO-Fc. Lika proteinbelastning verifierades genom Ponceau s-färgning och GAPDH användes som belastningskontroll i levervävnadslysater. *p < 0,05; **p < 0,01; ** * p < 0,001; n.s. inte signifikant; jämfört med fordonsbehandlad kontroll

western blot-analys bekräftade proteinuttryck av transgenerna i lever och serum. Som förväntat var bandet vid 58 kDa motsvarande Full längd GDF11PRO-Fc eller GDF11PRO-Fc D122A detekterbart hos behandlade möss. Serumnivåerna av propeptiden i full längd var något högre hos möss behandlade med AAV9-GDF11PRO-Fc D122A än hos de behandlade med AAV9-GDF11PRO-Fc, vilket tyder på att serumbeständigheten hos den aktiva propeptiden ökades genom d122a-mutationen (Fig. 5f).

sammantaget indikerar dessa resultat systemiskt uttryck av GDF11PRO-Fc och GDF11PRO-Fc D122A ökar skelettmuskelmassan hos dystrofa mdx-Möss och att denna skelettmuskelhypertrofi är förknippad med förbättringar i greppstyrka och motorisk koordination. Behandlingen verkade dock inte påverka muskeluthållighet baserat på löpbandslöpningsprestanda. Dessutom verkade d122a-mutanten vara något effektivare för att öka muskelmassan och funktionen, förmodligen på grund av förbättrad serumbeständighet.

systemisk GDF11PRO-Fc-genleverans minskar inte den dystrofa patologin hos mdx-möss

ett antal studier har rapporterat att blockad av TGF-Jacobi-ActRII-SMAD2/3-signalering, vare sig genom mstn-hämning eller blockad av ActRII, kan ha terapeutisk fördel i djurmodeller av DMD . För att bestämma effekten av aav9-GDF11PRO-Fc-behandling på den dystrofa patologin utförde vi histologisk analys av lemmusklerna och membranet.

karakteristiska tecken på dystrofisk patologi, inklusive muskelnekros, central kärnbildning, intramuskulär kollagenavsättning och närvaro av inflammatoriska infiltrat var tydliga i alla mdx-grupperna (Fig. 6a). I gastrocnemius reducerades den fibrotiska areaprocenten med-39% (p = 0,0273) hos möss behandlade med AAV9-GDF11PRO-Fc. Fibros i gastrocnemius minskade också något i aav9-GDF11PRO-Fc d122a-gruppen; på grund av hög intersubjektiv variabilitet i muskelmuskel intramuskulär fibros nådde denna skillnad emellertid inte statistisk signifikans (− 28%; p = 0,1230; Fig. 6b). Det fanns inte heller någon signifikant skillnad observerad i andelen centralt kärnbildade myofibrer, vilket tyder på att myofiberregenerering aktivt uppträdde i alla grupper (Fig. 6c). Serum CK, en markör för muskelnedbrytning, ändrades inte signifikant genom behandling (Fig. 6d). Dessutom var lokal försämring av myofibermembranintegritet, mätt med anti-mus IGG-immunofluorescensfärgning, uppenbar över alla mdx-grupperna. Oväntat uppvisade mdx-möss behandlade med AAV9-GDF11PRO-Fc D122A en liten ökning av IGG-positivt område i genomsnitt, men denna skillnad nådde inte statistisk signifikans (+ 55%; p = 0,1729; Fig. 6e och f; ytterligare fil 1: figur S5). Uppenbara tecken på myofibernekros, regenerering, central kärnbildning och IgG-penetrans var inte uppenbara i vildtypen C57BL/10J gastrocnemius, vilket indikerar att dessa markörer är specifika för den dystrofa patologin (Fig. 6a-f; ytterligare fil 1: figur S5).

GDF11PRO-Fc mildrar inte den dystrofa patologin hos mdx-möss. 6 veckor gamla mdx-möss behandlades med aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) eller vehikel (n = 7) via svansveninjektion. Åldersmatchade C57BL / 10J (n = 5) möss inkluderades också som en vild typkontroll. Möss euthaniserades 12 veckor efter behandlingen. en representant HE och MTC färgning från gastrocnemius tvärsnitt av C57BL / 10J och mdx möss. Central kärnbildning är uppenbar i alla mdx-grupper. Lokaliserade områden av myofibernekros och regenerering är markerade med en svart pil. Fibrotiskt område representeras av den blå regionen vid MTC-färgning. Skala staplar representerar 50 ubicm i he sektioner och 100 ubicm i MTC sektioner. B Fibrotiskt område i gastrocnemius uttryckt som en procentandel av det totala muskeltvärsnittsområdet. C procentandel av myofibrer som uppvisar central kärnbildning. D mätning av cirkulerande nivåer av serum CK, en markör för muskelskada. e representativa immunofluorescensbilder av mus – IGG-färgning (röd) i gastrocnemius vävnadstvärsnitt. Positiv färgning för IgG indikerar myofiberpermeabilitet mot serumproteiner och förlust av membranintegritet. Sektioner samfärgades med WGA för att visualisera enskilda myofibrer. Zoomat område är markerat med en vit ruta. Karakteristiska IGG-positiva myofibrer är avbildade med en vit pil. Skala staplar representerar 100 kubm. f området för IgG-positiva myofibrer uttryckt som en procentandel av det totala muskeltvärsnittsområdet. g representativ HE och MTC färgning från membran tvärsnitt av C57BL / 10J och mdx möss. Omfattande patologi är uppenbar i mdx men inte C57BL/10J möss. Skala staplar representerar 100 kubm. h Fibrotiskt område i membranet uttryckt som en procentandel av det totala tvärsnittsområdet. * p <0,05; ***p < 0,001; ****p < 0,0001; n. s. inte signifikant; jämfört med fordonsbehandlade mdx-kontroller

i membranet avslöjade h&e-färgning omfattande nekros och intramuskulär kollagenavsättning i både behandlade och obehandlade mdx-grupper (Fig. 6g). I likhet med vad som observerades i gastrocnemius-muskeln gav behandling med AAV9-GDF11PRO-Fc eller AAV9-GDF11PRO-Fc D122A en mild minskning av membran intramuskulär fibros totalt sett. Den genomsnittliga fibrotiska areaprocenten i membranet reducerades med 15% (p = 0,0328) och 17% (p = 0.019) med aav9-GDF11PRO-Fc respektive aav9-GDF11PRO-Fc d122a-behandling (Fig. 6h). Som förväntat var dessa patologiska egenskaper i stor utsträckning frånvarande i membranet av vild typ C57BL/10J möss (Fig. 6g och h). Från dessa data bestämmer vi att GDF11PRO-Fc och GDF11PRO-Fc D122A kan mildt hämma intramuskulär kollagenavsättning i lemmusklerna och membranet under en 3-månadersperiod. Behandlingen verkar emellertid inte stoppa den pågående cykeln av muskeldegenerering och regenerering i gastrocnemius eller membran hos vuxna mdx-möss.