Abstract

den aktuella studien utformades för att utvärdera oxidativ stress såväl som den terapeutiska effekten av Agaricus blazei Muril (A. Blazei) hos råttor med streptozotocininducerad diabetes. Vi använde 25 Wistar-råttor och DM inducerades genom att injicera streptozotocin (70 mg/Kg IP). Agaricus blazei Muril administrerades dagligen med start 40 dagar efter sjukdomsuppkomsten. A. Blazei testades som ett vattenhaltigt extrakt för dess fytokemiska sammansättning, och dess antioxidantaktivitet in vitro utvärderades också. Lipoperoxidation (LPO) och superoxiddismutas (SOD), katalas och glutationperoxidasaktiviteter mättes i lungvävnaden, liksom närvaron av inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS), genom immunhistokemi. En anatomopatologisk studie utfördes också. Fytokemisk screening av A. Blazei upptäckte närvaron av alkaloider och saponiner. Extraktet uppvisade en signifikant antioxidantaktivitet i dpph-rensningen och hipoxantin/xantinoxidasanalyserna. Pulmonell LPO ökade hos diabetiska djur (;) jämfört med kontrollgruppen (), följt av en minskning av den A. Blazei-behandlade gruppen (;). iNOS hittades ökat i lungan hos diabetiska råttor och reducerades i den A. Blazei-behandlade gruppen. Lungvävnaden hos diabetiska råttor visade oxidativa förändringar relaterade till streptozotocin-behandlingen. A. Blazei-behandlingen minskade effektivt oxidativ stress och bidrog till vävnadsåtervinning.

1. Introduktion

Diabetes mellitus (DM) är en endokrin metabolisk sjukdom med växande förekomst och klinisk relevans med hög sjuklighet och dödlighet . Bland dess kroniska komplikationer är mikro-och makrovaskulära störningar relaterade till njur -, kardiovaskulära och nervsystemet . Under de senaste två decennierna har emellertid förändringar i andningsfunktionen också rapporterats i kliniska och experimentella studier. Minskningar i lungfunktionen genom åren, relaterade till de minskade måtten på lungvolymer och kapacitet, bevisades hos diabetespatienter med nedsatt metabolisk kontroll . Strukturella förändringar i basalmembranet i lungkapillärendotelet finns också i DM, med en förtjockning av alveolus-kapillärmembranet och minskning av diffusionsförmågan . Dessutom är diabetespatienter mer mottagliga för lunginfektioner, särskilt tuberkulos, som har en fyra gånger större förekomst i denna speciella population . Även om alla dessa förändringar bevisades i kliniska och experimentella studier, undersökte få studier de viktigaste fysiopatologiska mekanismerna som involverade lungkomplikationer relaterade till DM.

det finns 4 vägar associerade med kroniska komplikationer av DM, nämligen polyolvägen, proteinkinas C (PKC) aktivering, ökat flöde i hexosaminvägen och vägen för avancerade glykosilationslutprodukter (ålder). Även om det presenteras olika i varje fall är oxidativ stress (OS) inblandad i de fyra vägarna som nämns ovan .

det finns gott om bevis som visar att ökningen av kväveoxid (NO), bildad av verkan av inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS) är en av de faktorer som är ansvariga för både patogenesen och komplikationerna som härrör från DM . Användningen av exogena antioxidanter kan utgöra en stor terapeutisk potential för behandling av DM

basidiomycete Agaricus blazei Murill (A. Blazei), populärt känd som ”solsvamp”, är infödd i Brasilien och odlas allmänt i Japan på grund av dess medicinska egenskaper. Denna svamp används traditionellt vid behandling av ateroskleros, hepatit, hyperlipidemi, dermatit och cancer, och det har visat sig ha immunmodulerande och antimutagena effekter både in vivo och in vitro. Polysackarider är ansvariga för funktionen av immunologisk och antitumoral stimulering .

A. Blazei har redan visat sig vara fördelaktigt vid insulinresistens relaterad till typ 2-diabetes, men ingen studie har visat antioxidantpotentialen hos A. Blazei in vivo i DM . Således utformades denna studie för att utvärdera oxidativ stress såväl som den terapeutiska effekten av A. Blazei i lungvävnaden hos djur med streptozotocin-inducerad DM.

2. Metoder

2.1. Svampar

lufttorkade svampar av arten Agaricus blazei Murill (C-typ) var en gåva från Dr.Luiz Ant Jaconio Graciollo, Institutionen för Engeneering vid State University of S.

2.2. Beredning av A. blazei vattenhaltigt extrakt

lufttorkade delar (100 g) maldes och det vattenhaltiga extraherade bereddes genom infusion (1/10 svamp/lösningsmedel). Infusionen stod vid rumstemperatur i 30 minuter. Efter kylning och filtrering frystes extraktet och koncentrerades genom lyofilisering i fem dagar över natten för att erhålla A. blazei vattenhaltigt extrakt.

2, 3. Kemikalier och reagenser

2,2-Difenil-1-picrylhidrazyl (DPPH), hypoxantin, xantinoxidas, trolox och salicylsyra köptes från Sigma (St.Louis, USA).

2, 4. Fytokemisk Screening

fytokemisk analys (flavonoider, tanniner, antrakinoner, alkaloider, saponiner, kumariner och hjärtglykosider) av A. blazei utfördes enligt de metoder som beskrivs av Harborne . De tunna skiktkromatografianalyserna utfördes efter system och utvecklare indikerade av Wagner och Bladt .

2,5. Hypoxantin / Xantinoxidasanalys

metoden som användes för att analysera hydroxylradikalrensningsförmågan hos extrakten baserades på metoden för Owen et al. . I korthet löstes extraktet i analysbufferten (hypoxantin, Fe(III), EDTA och salicylsyra) i en koncentration av 2,0 mg/mL och späddes på lämpligt sätt (i tre exemplar) i analysbuffert till en slutlig volym av 1.0 mL ger ett intervall på 0,1-2,0 mg/mL. En 5 L alikvot xantinoxidas upplöst i 3,2 M (NH4)2SO4 tillsattes för att initiera reaktionen. Provrören inkuberades i 3 timmar vid 37 kg C, vid vilken tidpunkt reaktionen var fullständig. En 30 L alikvot av reaktionsblandningen analyserades med HPLC med användning av kromatografiska betingelser såsom beskrivits av Owen et al. . Kromatografisk analys gjordes med användning av en gradient baserad på metanol/vatten/ättiksyra med en omvänd faskolonn av ACI-bondapak C18 och detektion vid 325 nm. HPLC-utrustningen hade en 2695 separationsmodul och UV-detektor 2487. Hydroxyleringen av salicylsyra och hypoxantin övervakades vid A = 325 respektive a = 278 nm. Mängden dihydroxifenoler (2,5-dihydroxibensoesyra och 2,3-dihydroxibensoesyra) (2,5-DHBA och 2,3-DHBA) framställd genom hydroxylradikal (OH•) attack på salicylsyra bestämdes från standardkurvor beredda med respektive rena dihydroxifenoler.

2,6. Dpph-Rensningsanalys

rensning av dpph-fria radikaler mättes med användning av en modifierad metod som beskrivs av Yamaguchi et al. i vilka de olika metanolväxtekstrakten tillsattes till Tris-HCl (100 mM) Buffert, pH 7,0, innehållande 250 mM DPPH upplöst i metanol. Minst sex olika utspädningar av varje extrakt testades och fick stå 20 minuter i mörkret innan absorbansen mättes vid 517 nm med en Shimadzu spektrofotometermodell UV-1602pc (Kyoto, Japan). Experimentet utfördes i tre exemplar. Antioxidantaktivitet (AOA) uttrycktes som IC50 (hämmande koncentration i g/mL prover eller positiva kontroller som är nödvändiga för att minska absorptionen av DPPH med 50% jämfört med den negativa kontrollen). Ju lägre IC50, desto högre är AOA .

2,7. Djur och experimentellt protokoll

det experimentella protokollet som användes överensstämde med de normer som fastställts av etiska och Hälsoforskningsutskottet för gruppen för forskning och forskarutbildning vid Hospital de cl Jaconicas i Porto Alegre samt med principerna för forskning som involverar djur (NAS). Endast manliga Wistar-råttor användes, erhållna från avelskolonin i Instituto de ci Ubigncias B Ubisicas da sa Obirade da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Medelvikten för djur i början av studien var 200-300 gram. De hölls under en 12: 12 timmars ljus/mörk cykel (ljus från 7 AM till 7 pm) i en temperaturkontrollerad miljö (22 ml 4 kg c).

DM inducerades genom en enda injektion av streptozotocin i. p. (STZ, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA) i en dos av 70 mg/Kg kroppsvikt . STZ löstes i natriumcitratbuffert (0,1 m, pH 4.5) och administreras i djurets vänstra bukregion cirka 10 minuter efter upplösning i buffertlösningen. Djuren i kontrollgruppen fick endast NaCl 0,9% IP vid samma volym av bufferten som användes för att lösa upp STZ. A. blazei-extraktet späddes till koncentrationen av 0,1 g / mL (10%) i en lösning av destillerat vatten och lämnades i 2 timmar vid rumstemperatur . Administreringsvägen var gastrisk sondmatning med en slutlig lösning på 2 mL och behandlingen initierades från den 40: e dagen av diabetesinduktion. Djuren randomiserades i de olika grupperna: kontroll (CO), diabetiker behandlad med NaCl (DM) och diabetiker behandlad med A. blazei (DM + A. blazei). Blodprover samlades in från retro-orbital plexus en dag före induktion och 2 och 30 dagar efter experimentets början. I slutet av de 60 dagarna av försöket inducerades djuren till eutanasi genom exsanguination, efter bedövning med xilasin och ketamin. Blod från retro-orbital plexus samplades och den högra lungan dissekerades ut och hölls i 4% formaldehyd för histologisk analys. Den vänstra lungan avlägsnades och frystes vid -80 kg C för ytterligare analyser.

2,8. Serumanalyser

blodproverna placerades i ett provrör med heparin (Liquemine) för att undvika koagulering. Materialet centrifugerades sedan vid 1.800 g i 15 minuter. Fällningen kastades och plasman avlägsnades.

för att bestämma glukos -, kolesterol-och triglyceridnivåer använde vi det kolorimetriska enzymatiska testet (Kit Labtest, Bio Diagnostica) och absorbans mättes i spektrofotometer (CARY 3e-UV-synlig spektrofotometer Varian). Djur med en glukoskoncentration över 250 mg/dL betraktades som diabetiker.

2,9. Biokemiska analyser av oxidativ Stress och Antioxidantanalys

lungorna homogeniserades med 9 mL fosfatbuffert (KCL 140 mM, fosfat 20 mM, pH 7,4) per gram vävnad. Proteinkoncentrationen i dessa lunghomogenater bestämdes med användning av en standardlösning av bovint albumin enligt Lowry et al. .

pulmonell lipoperoxidation bestämdes med metoden för tiobarbitursyra reaktiva substanser (TBA-RS) .

superoxiddismutas (SOD) aktivitet i lungvävnaden bestämdes med användning av en teknik baserad på inhiberingen av adrenokrombildning vid epinefrinautoxidation . Katalas (katt) aktivitet i lungvävnaden bestämdes som beskrivet någon annanstans och bestämningen av selenberoende glutationperoxidas i lungvävnaden erhölls genom en teknik bestående av måttet på NADPH-oxidation med glutationreduktas .

2.10. Histologisk studie

för histologisk analys var proverna inbäddade i paraffin två gånger. Med hjälp av en mikrotom skars paraffinblocken i 3-m seriate sektioner. I färgningsfasen nedsänktes glidbanorna i hematoxylin – eosin och picrosirius. I uttorkningsfasen gick strukturerna genom tre behållare med absolut alkohol och två behållare med xylol. Läsning utfördes med ljusmikroskopi (Nikon Labophot) vid 100. Analysen utfördes av 2 patologer som inte kände till studiens detaljer.

2.11. Immunohistokemisk detektion av Inos

immunohistokemiska reaktioner utfördes i lungvävnadssektionerna genom tekniken för streptavidin-biotin peroxidaskomplex (StreptABC, DAKO). Glidbanorna var tidigare belagda med en silanlösning (APTS, Sigma) utspädd i 4% aceton. 3-m tjocka sektioner erhölls med användning av en mekanisk mikrotom. Sektionerna deparaffiniserades sedan och nedsänktes successivt i xylol och etanol och underkastades antigen återhämtning genom bestrålningsvärme i tryckkokare (Eterna, Nigro) med citratbuffert (10 mM, pH 6.0) i 15 minuter. Peroxidasblockering utfördes med användning av en väteperoxidlösning vid 3%, följt av inkubation med primär antikropp mot NOS-2 (iNOS, 1 : 40, Santa Cruz). Reaktionerna märktes med diaminobenzidin (DAB, Sigma) – lösning vid 60 mg% och motsattes med Harris hematoxylin (Merck). För varje reaktion användes en positiv kontroll till vävnad som var känd för att vara positiv för den testade antikroppen. Två negativa kontroller användes också, den första genom frånvaro av den primära antikroppen och den andra genom att avlägsna den sekundära antikroppen under reaktionsstegen. Fallen ansågs vara iNOS-positiva när den bruna färgen med minst måttlig intensitet var synlig i cellcytoplasman och i mer än 10% av cellerna.

2.12. Statistisk analys

datan presenteras som genomsnittlig standardavvikelse (SD) och analyserades genom statistisk programvara SPSS 15.0. Variablerna testades för normalitet genom Kolmogorov-Smirnov-testet. Envägsanalys av varians (ANOVA) användes för skillnader mellan grupper. Student Newman-Keuls post hoc-test användes för parametriska variabler och Kruskal-Wallis för de icke-parametriska. Nivån av betydelse som användes var .

3. Resultat

3.1. Fytokemiska analyser

fytokemiska analyser av A. blazei indikerade närvaron av saponiner och alkaloider. Andra sekundära metaboliter såsom antrakinoner, hjärtglykosider, kumariner, flavonoider, fenolsyror och tanniner detekterades inte.

3.2. Hypoxantin / xantinoxidas in Vitro-analys

extraktets antioxidantaktivitet in vitro bestämdes genom övervakning av produktionen av hydroxylbensoesyror (DHBA) som en produkt av hydroxylradikalangreppet på salicylsyra i hipoxantin-xantinoxidasanalysen. Reduktionen av totala oxidationsprodukter som en funktion av koncentrationen av A. blazei vattenhaltigt extrakt tillsatt till analysen resulterade i en in vitro antioxidantkapacitet på ett dosberoende sätt. Det vattenhaltiga extraktet av A. blazei minskade bildningen av båda DHBA-arterna till 45.2 % i den högsta koncentrationen som används (2 mg/mL). IC50-värdet beräknades och befanns vara 0,99 mg/mL. En andra typ av svamp (Lentinula edodes) för vilken författarna inte hittade närvaron av alkaloider användes som kontrollprov (IC50 på 1,95 mg/mL). Trolox (vitamin E) användes som positiv kontroll och visade en IC50 på 0,34 mg/mL (Figur 1).

Figur 1

hämning av generering av reaktiva syrearter genom vattenhaltiga extrakt av luftdelar av Agaricus blazei (), Lentinula edodes () och Trolox, används som positiv kontroll () med hjälp av hypoxantin / xantinoxidasystemet. Datapunkter presenteras som medelvärde för Xiaomi SD, = 3.

3.3. Dpph-Rensningsanalys

friradikalrensningseffekten av båda A. blazei vattenhaltigt extrakt, L. edodoes vattenhaltigt extrakt, såväl som trolox, som positiv kontroll, testades med användning av dpph-friradikalrensningsanalysen . IC50-värdena för A. blazei vattenhaltigt extrakt och för L. edodes-extrakt visas i Tabell 1. Resultaten av friradikalrensningseffekten av trolox (IC50 = 0,02 mg/mL), som användes som positiv kontroll, användes för att validera analysen. Även om friradikalrensningskapaciteten hos extrakten var lägre (högre koncentration är nödvändig för att minska absorptionen av DPPH med 50%) än effekten av trolox, A. blazei vattenhaltigt extrakt (med högsta flavanoninnehåll) presenterade lovande antioxidantaktivitet med en IC50 på 1, 77 mg/mL. L. edodes hade å andra sidan den lägsta rensningsaktiviteten (IC50 = 3, 22 mg/mL) vilket överensstämmer med frånvaron av alckloider i denna svampart.

3.4. Kroppsvikt och Serumanalyser

kroppsvikten hos diabetiska djur reducerades signifikant och A. Blazei-behandlade djur gick ner i vikt ännu mer (Tabell 2). A. Blazei-extraktet minskade uppenbarligen glykemi hos diabetiska råttor () men den glykemiska kurvan var liknande över diabetiker och behandlade djur. Emellertid minskade A. Blazei signifikant de totala kolesterol-och triglyceridnivåerna (). Dm-och DM + A. Blazei-grupperna hade olika provstorlekar på grund av den högre dödligheten hos djuren i DM-gruppen under experimentet.

3.5. Biokemisk analys och oxidativ Stress

A. Blazei minskade signifikant () lipoperoxidationsnivåerna enligt TBA-RS (tabell 3). Aktiviteten hos antioxidantenzymerna SOD och CAT visade emellertid inga skillnader mellan grupperna. Enzym GPX-aktivitet ökade signifikant i diabetesgruppen och minskade i den A. Blazei-behandlade gruppen ().

3.6. Histologisk analys

STZ-inducerad Diabetes Mellitus orsakade allvarlig vaskulär skada på lungvävnaden(Figur 2 (c)), där alveolära förändringar såsom septabrott också bevisades. Picrosirius-färgning avslöjade en expansion av konjunktivvävnaden i det alveolokapillära utrymmet i diabetesgruppen (Figur 2(d)) och en uppenbar återgång av detta mönster i den Ab-behandlade gruppen (Figur 2(f)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figure 2

histologi av lungvävnad färgad av HE (A, c och e) och picrosirius (b, d och f). Förstoring 100: (A) och (b): kontroll, (c) och (d): Diabetes Mellitus, (e) och (f): Diabetes Mellitus behandlad med Agaricus blazei.

3.7. Immunohistokemisk analys av iNOS

Figur 3 visar iNOS fördelning i lungvävnaden som detekteras genom immunohistokemi. Den positiva fläcken i brunt som ses i lungbronchialepitelet och kapillärendotelet i DM-gruppen indikerade iNOS-positivitet. iNOS-färgning var mindre uppenbar i A. Blazei group and absent in the CO group.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 3

iNOS immunohistochemistry in lung tissue. Magnification 400: There was no staining in the control group (a); reduction in the treated group (b) versus DM (c).

4. Diskussion

resultat av friradikalrensningseffekten av A. blazei vattenhaltigt extrakt i hipoxantin / xantinoxidas in vitro-analys och i dpph-friradikalrensningsanalysen visade en signifikant antioxidantaktivitet in vitro. I båda analyserna uttryckte extraktet en högre antioxidantaktivitet, i jämförelse med det vattenhaltiga extraktet av L. edodes, som är en annan svampart och som endast presenterar saponiner, men inte alkaloider eller flavonoider eller tanniner. Det har föreslagits av Ribeiro et al. att antioxidantaktiviteten kan vara relaterad till närvaron av alkaloider i svampen. Med andra ord genererar högre alkaloidkoncentrationer bättre antioxidantaktivitet .

huvudfyndet i denna studie var minskningen av pulmonell lipoperoxidation hos råttor med streptozotocininducerad diabetes efter behandling med Agaricus blazei. Tidigare studier har visat en glykemi-reducerande effekt, vilket minskar insulinresistensen och ökar frisättningen av det genom bukspottkörtelceller . Men A. Blazei-behandling här visade en fördelaktig effekt avseende variablerna relaterade till oxidativ stress, trots att de inte minskade hyperglykemi.

Kim et al. beskrivna antidiabetogena effekter av-glukaner extraherade från A. Blazei och dess enzymatiskt hydrolyserade oligosacharider, utvärdering av in vitro och in vivo effekter i odling av-bukspottkörtelceller och hos djur med streptozotocin-inducerad diabetes. Efter behandling med-glukaner och oligosakarid uppvisade djuren minskningar av glykemi, triglycerider och kolesterolnivåer och i aterosklerotisk aktivitet . I vår studie utfördes behandlingen med användning av ett grovt extrakt av A. Blazei, utan att isolera någon av dess föreningar, och detta är förmodligen förklaringen till bristen på antiglykemisk verkan.

extraktet av A. Blazei visade in vitro och in vivo antioxidantaktivitet, men behandlingen minskade signifikant djurens vikt. Detta faktum kan förklaras på grund av höga doser av A. blazei-extrakt som används i detta experiment, olika doser som används i andra studier som inte visar viktminskning . I en studie för att utvärdera 90-dagars subkronisk toxicitet hos ett vattenhaltigt extrakt hos råttor fanns det emellertid inga konsekventa behandlingsrelaterade förändringar i kliniska tecken, kroppsvikt och livsmedelskonsumtion vid dosen 2654 mg kg−1 för hanråtta, en högre dos än vad som användes i vår studie . Fler studier var nödvändiga för att utvärdera den toxiska effekten av A. Blazei i dessa doser, med analys av specifika variabler.

GPx ökade signifikant i diabetesgruppen och reducerades signifikant efter A. Blazei-behandling. Denna ökning av GPx kan redogöra för de minskade nivåerna av minskad glutation, eftersom det är huvudsubstratet som reglerar dess aktivitet. Gumieniczek et al. visat att i experimentell DM är den pulmonella oxidativa stressen närvarande på grund av minskningen av antioxidantenzymaktivitet och ökad lipoperoxidation. Sådana förändringar är mer signifikanta efter veckor efter induktion. Under DM finns en minskning av Cu, Zn-SOD-aktivitet och en ökning av katalasaktivitet . I vår studie ändrades varken SOD-eller katalasaktivitet i ingen av de olika grupperna. En möjlig förklaring till våra resultat som skiljer sig från Gumieniczek är att i vår studie utfördes analysen av antioxidantenzymer tidigare.

i vår experimentella modell observerades många histologiska förändringar i lungsystemet. Dessa förändringar överensstämmer med de som rapporterats i litteraturen , särskilt när det gäller ökningen av konjunktivvävnaden och förtjockningen av basala lamina som observerats genom tekniken för picrosiriusfärgning. Efter behandling med A. Blazei blev sådana förändringar mindre uppenbara. Bildandet av intra-och intermolekylär bindning med kollagen, som härrör från glykosilationsprocessen, leder till strukturella förändringar i vävnadsproteiner såsom ökad styvhet, resistens mot proteolytisk digestion och den extracellulära matrisen (inklusive fibronektin, prokollagen sug2, typ III, IV och vi kollagen och laminina) . I vår studie kan huvudfaktorn för reversion av denna process efter behandling med A. Blazei förklaras av minskningen av skador som härrör från den oxidativa stressen som demonstreras av minskningen av pulmonell lipoperoxidation.

ett långsiktigt hyperglykemiskt tillstånd är relaterat till förändringar i iNOS-uttryck i flera vävnader . I den immunhistokemiska analysen av vår studie ökade iNOS signifikant i lungvävnaden hos diabetiska råttor och minskade signifikant när djuren behandlades med A. Blazei. Studier har visat att mRNA-uttryck av endotel kväveoxidsyntas (Enos) reduceras, medan iNOS kan ökas tillsammans med genereringen av cykliskt guanosinmonofosfat (c-GMP) .

i en nyligen publicerad studie utvärderades lipoperoxidation, superoxiddismutasaktivitet och fördelningen av iNOS-Och Enos-isoformer i lungvävnaden hos diabetiska råttor. En ökning av oxidativ stress i samband med den ökade iNOS i lungvävnaden hos diabetiska råttor observerades, vilket vändes i gruppen behandlad med antioxidanten Javi-liposyra . Dessa resultat överensstämmer med de som rapporterats i föreliggande arbete, såsom den observerade ökade oxidativa stressen, de histologiska lungförändringarna och effekten av en antioxidantterapi i denna DM-modell.

den aktuella studien visar den positiva effekten av A. Blazei vattenhaltigt extrakt avseende oxidativa stressvariabler och lungmorfopatologi vid streptozotocin-inducerad diabetes. Dessa resultat kan bidra avsevärt till en bättre förståelse av lungfysiopatologin i DM. Vår studie är också relevant och med avseende på den terapeutiska potentialen hos A. Blazei.

bekräftelse

detta arbete stöddes av bidrag från de brasilianska byråerna ”fundo de incentvo Jacobi Pesquisa e Eventos (FIPE) do Hospital de cl Secondnicas de Porto Alegre (HCPA)” och ”laborat Sacrio de Hepatologia e Fisiologia Experimental da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (HCPA/UFRGS)”.