absorptionsspektra

absorptionsspektret av tiamin registrerades mot vatten (Figur 1), Det visade sig att tiamin uppvisar en maximal absorptionstopp (Max. På grund av högt blåskiftade Xi max av tiamin, är dess bestämning i doseringsformen baserad på den direkta mätningen av dess absorption för ultraviolett mottaglig för potentiella störningar från de vanliga hjälpämnena. Därför var derivatisering av tiamin för att uppnå synliga absorberande arter utan tvekan nödvändigt. Således utfördes derivatisering av tiamin med NBD-Cl, och produktens absorptionsspektrum registrerades mot reagensämne (Figur 1). Det visade sig att produkten är brunfärgad som uppvisar audmax vid 434 nm, och NBD-Cl-NBD-CL-NBD-CL-NBD-CL-NBD-CL-NBD-CL-NBD var 342 nm. Den X-X av tiamin-NBD-Cl-derivat var röd-skiftas, vilket eliminerar eventuella störningar. Våglängden 434 nm fixerades därför som optimal.

optimering av reaktionsbetingelserna

Figur 1: absorptionsspektra av tiamin (3), NBD-Cl (2) och komplexet mellan dem (1).

de optimala förhållandena för den utvecklade metoden fastställdes genom att variera parametrarna en i taget medan de andra parametrarna var konstanta och följde effekten på absorptionen av den färgade produkten. För att fastställa experimentella förhållanden undersöktes effekten av olika parametrar såsom pH, tid, buffertvolym och koncentration av NBD-Cl.

effekt av pH

effekten av pH på reaktionen mellan tiamin och NBD-Cl testades genom att variera pH-formen 7,0 till 12,0. Såsom visas i Figur 2 är absorptionen av produkten låg vid pH 7,0, vilket indikerar att tiamin inte kan reagera med (NBD-Cl) i neutrala medier. Detta berodde möjligen på förekomsten av aminogruppen av tiamin i form av hydrokloridsalt, vilket hämmar nukleofil substitutionsförmåga. När pH ökade från 7 till 12 ökade avläsningarna dramatiskt, vilket frigjorde aminogruppen av tiamin och underlättar nukleofil substitution. Maximal absorption uppnåddes vid pH-värde av 10,5. Vid pH-värden mer än 10,5 inträffade en minskning av absorptionen. Detta berodde troligen på ökningen av mängden hydroxidjon som ökar hastigheten för bakåtreaktionen av tiamin med NBD-Cl.

effekt av reaktionstid

absorptionen av reaktionsprodukten övervakades vid olika tidpunkter (Figur 3). Att hålla andra förhållanden intakta följdes absorberingen av reaktionsprodukten efter att ha stått under olika tidsintervall vid 25 kg C. resultaten visar att tiamin reagerar med NBD-Cl vid 25 kg C och absorbansen börjar öka gradvis och nå maximalt efter 25 minuter. Under längre reaktionstider observerades en liten minskning av absorbansen. Följaktligen sattes 25min som den lämpliga reaktionstiden för bestämning.

effekt av buffertmängden

Figur 2: Effekt av pH på reaktionen av tiamin med NBD-Cl.
tiamin (20 CG / ml): 1 ml, NBD-Cl conc. 0, 2% (w/v), reaktionstid 20 min.

Figur 3: Effekt av reaktionstid på reaktionen av tiamin med NBD-Cl.
tiamin (20 kg / ml): 1 ml, Buffert (pH 10.5): 1,5 ml, NBD-Cl conc. 0,2% (vikt / vikt).

genom att hålla pH vid 10,5 studerades också effekten av mängden buffertlösning på absorptionen av reaktionsprodukten (Figur 4). Figuren avslöjar att absorberingen av reaktionsprodukten ökar snabbt med ökningen av mängden buffertlösning och blir maximal när mängden buffertlösning når 1,5 mL. Därför valdes mängden 1,5 mL buffertlösning för att säkerställa den högsta absorbansen.

effekt av NBD-CL-koncentration

studien av effekten av NBD-Cl-koncentrationer visade att reaktionen var beroende av reagenskoncentrationen. Den högsta absorptionsintensiteten uppnåddes vid NBD-Cl-koncentration på 0,2% (w / v), och högre koncentration av NBD-Cl leder till en minskning av absorbansen (Figur 5).

från ovanstående parameterjusteringsexperiment var de optimerade betingelserna som användes för analysen: pH 10,5, NBD-Cl-koncentration 0,2% (w / V), buffertens volym 1,5 mL, reaktionstid 25min och temperatur 25 UCCC.

Figur 4: effekt av Buffertmängd (ml) på reaktionen av tiamin med NBD-Cl.
tiamin (20 CG/ml): 1 ml, Buffert pH: 10,5, NBD-Cl conc. 0, 2% (w/v), reaktionstid 25 min.

Figur 5: effekt av NBD-Cl-koncentration på dess reaktion med tiamin.
tiamin (20 kg / ml): 1 ml, Buffert (pH 10,5): 1,5 ml, reaktionstid 25 min.

validering av metoden

metoden validerades för följande parametrar: specificitet, linjäritet, precision, noggrannhet, detektionsgräns (LOD), kvantifieringsgräns (LOQ) och robusthet enligt International Conference on Harmonization (ich) riktlinjer .

linjäritet, detektionsgräns (LOD) kvantifieringsgräns (LOQ)

linjäriteten utvärderades genom linjär regressionsanalys bestämd genom att konstruera sju koncentrationer av tiamin, i intervallet 05–35 kubg/mL, som beräknades med den minsta kvadratiska regressionsmetoden för att beräkna kalibreringsekvationen och korrelationskoefficienten. Kalibreringskurvorna konstruerades genom att plotta koncentration kontra absorbans, med användning av linjär regressionsanalys. Regressionsekvationen för resultaten var A=0,033 x-0,009 (r2=0,999), där A är absorbansen vid 434 nm, x är koncentrationen av tiamin i Cu/mL i intervallet 05-35 cu/mL och r är korrelationskoefficient (Tabell 1). Det visade sig att det linjära koncentrationsområdet är jämförbart med vår tidigare metod med NQS . Detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ) bestämdes enligt följande formel LOD=3.3 SDA / B, och LOQ=10 SDA/b, SDa är standardavvikelsen för avlyssningen; b är lutningen enligt ich-riktlinjerna . LOD och LOQ befanns vara 0,667 respektive 2,020 mikrosekg/mL (Tabell 1).

noggrannhet

noggrannheten för den föreslagna metoden utfördes genom att applicera 3 olika koncentrationer 10, 20 och 30 mikrosekg / mL tiaminläkemedel inom linjärt intervall beräknat som procentandelen av läkemedlet återvunnet från proverna (Tabell 2).

relativt fel (RE) var inom 0,24% med motsvarande standardavvikelse inom 0,004 för tre olika bestämningar (tabell 3).

robusthet

reaktionsmekanism: det har rapporterats att NBD-Cl reagerar med aminogrupp av primära eller sekundära aminderivat . På liknande sätt kan aminogrupp av tiamin fungera som en nukleofil på grund av det ensamma paret av elektroner på kväveatomen, trending att attackera på elektronbristcentret i NBD–Cl (Tabell 4 & Figur 6). Samtidigt har det visat sig att produktens sammansättning är 1:1 av tiamin och NBD-Cl (Figur 7). Så det dras slutsatsen att aminogruppen av tiamin reagerar med NBD-Cl för att bilda en brun addukt. Reaktionsekvationen visas i Figur 7.

Figur 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

tillämpning av den föreslagna metoden på analys av tiamindosform

Tiamintabletter utsattes för analysen av den föreslagna och etikettkravet överensstämmer väl med vår nya metod som visas i Tabell 5. Den föreslagna metoden har fördelen att den är praktiskt taget fri från störningar av hjälpämnen.

Figure 7: Reaktion av tiamin med NBD-Cl som visar 1: 1 stökiometri.