GDF11PRO-Fc se leagă atât de GDF11, cât și de MSTN

pentru dimerul GDF11 Matur activ printr-o interacțiune directă, ne-am propus să identificăm o interacțiune proteină-proteină între gdf11 și gdf11pro-FC. În plus, datorită omologiei structurale strânse a dimerilor maturi GDF11 și MSTN, am dorit, de asemenea, să determinăm dacă GDF11PRO-Fc se asociază cu MSTN. Pentru a identifica aceste interacțiuni proteine-proteine, am efectuat un set de teste pull-down (Fig. 1). Liganzii rGDF11, rMSTN și rActivin A au fost incubați cu fracțiuni de lizat din celule HEK293 transfectate cu o plasmidă care codifică GDF11PRO-Fc sau Mpro-Fc la pH 7,4. Datorită fragmentelor Fc conjugate pe propeptidele modificate, fracțiile ar putea fi trase în jos direct pe o proteină a/g rășină de agaroză. Așa cum era de așteptat, GDF11PRO-Fc a tras efectiv atât rGDF11, cât și rMSTN, indicând faptul că GDF11PRO-Fc era capabil să lege ambii liganzi. În plus, MPRO-Fc a doborât cu succes atât rGDF11, cât și rMSTN. Atât GDF11PRO-Fc, cât și Mpro-Fc nu au reușit să tragă în jos superfamilia ligandului ractivin A mai îndepărtat TGF-XV, indicând faptul că legarea ligandului este specifică (Fig. 1). Nu s-a observat legarea GDF11PRO-Fc, Mpro-Fc, rGDF11, rMSTN sau rActivin A pe o rășină de agaroză martor fără proteină A/G. Din aceste rezultate, concluzionăm că GDF11PRO-Fc se asociază spontan cu dimerii maturi GDF11 și MSTN la pH fiziologic.

GDF11PRO-Fc se asociază cu GDF11 și MSTN. Interacțiunile proteină-proteină dintre GDF11PRO-Fc sau Mpro-Fc și rGDF11, rMSTN sau rActivin A au fost determinate printr-un test pull-down. GDF11PRO-Fc sau Mpro-Fc a fost incubat cu rGDF11, rMSTN sau rActivin a timp de 1 oră la 4 ct. Complexele proteice fuzionate Fc au fost separate pe o rășină de agaroză acoperită cu proteine A/G, iar eluații au fost executați pe un gel de 12% SDS-PAGE în condiții de reducere și probate de western blot. Controlul de intrare a fost de 5% din materialul de intrare. WB Western blot

GDF11PRO-Fc blochează atrofia indusă de GDF11/MSTN în miotuburile c2c12

adăugarea de rGDF11 și rMSTN la miotuburile diferențiate s-a dovedit anterior că induce atrofie în c2c12 murin și MYOTUBES . După ce am stabilit că GDF11PRO-Fc leagă GDF11 și MSTN, am întrebat dacă GDF11PRO-Fc ar putea preveni atrofia MIOTUBULUI indusă de GDF11/MSTN în myotuburile diferențiate c2c12. Pentru a realiza acest lucru, am ambalat codificarea secvenței ADN pentru GDF11PRO-Fc în capsida AAV6 pentru a genera vectorul Aav6-GDF11PRO-Fc. În aceste experimente, vectorul AAV6 a fost selectat pentru capacitatea sa de a transduce în mod eficient și selectiv miotuburi diferențiate c2c12, dar nu mioblaste . Mioblastele C2C12 au fost cultivate și diferențiate timp de 5 zile înainte de tratamentul cu Aav6-GDF11PRO-Fc sau AAV6-EGFP (vector de control) la un MOI de 105 (Fig. 2a). Așa cum era de așteptat, expresia GFP a fost observabilă la miotuburile c2c12 infectate cu AAV6-EGFP la 48-72 ore postinfecție, iar cuantificarea copiilor genomului vector internalizat per genom diploid la 72 ore postinfecție a indicat că transducția vectorială a fost realizată în mod adecvat (Fig. 2b și c).

GDF11PRO-Fc blochează atrofia MIOTUBULUI indusă de GDF11 / MSTN în celulele C2C12. o schemă care detaliază cronologia experimentală în myotuburile c2c12. Aav6-EGFP sau AAV6-GDF11PRO-Fc a fost adăugat la miotuburile C2C12 la un MOI de 105 în ziua 5 post-diferențiere și 100 ng/ml rGDF11 sau rMSTN a fost adăugat în ziua 7. Miotuburile au fost colorate și analizate în ziua 10. B expresia EGFP a fost evidentă la 48-72 ore în miotuburile C2C12 tratate cu AAV6-EGFP (MOI 10 ). Barele de scară reprezintă 50 de metri cubi. Numărul copiei genomului Vector C per genom diploid în miotuburile c2c12 72 h după adăugarea AAV6-EGFP sau AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10 ). d imagini reprezentative de imunofluorescență ale miotuburilor C2C12. Membranele myotube C2C12 au fost vizualizate prin colorare cu un anticorp anti-distrofină (roșu). Nucleele au fost colorate cu DAPI (albastru). Inset prezintă o regiune mărită. Barele de scară reprezintă 50 de metri cubi (panoul principal) și 25 de metri cubi (panoul interior). e fracția nucleelor încorporate în miotuburi (indicele de diferențiere) a fost calculată și prezentată ca procent din martor. f diametrul mediu al miotubului în raport cu controlul și (g) distribuția măsurătorilor diametrului. Pentru măsurătorile diametrului miotubului, fiecare miotub a fost măsurat în trei puncte de-a lungul lungimii miotubului și a fost calculat în medie. h numărul de nuclee încorporate pe miotub. Au fost analizate minimum 50 de miotuburi pentru fiecare condiție experimentală. i pSMAD2/3 în raport cu tSMAD2 / 3 a fost evaluată prin western blot. Încărcarea egală a proteinelor a fost verificată prin colorarea Ponceau S, iar GAPDH a fost utilizat ca control al încărcării. Datele reprezintă rezultatele a trei experimente separate. Toate barele de eroare reprezintă valoarea medie a sem. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Șaptezeci și două de ore mai târziu, miotuburile au fost fixate și colorate pentru analiza imunofluorescenței folosind un anticorp care recunoaște distrofina (tija 22/tija 23) pentru a vizualiza membranele periferice ale miotubului și DAPI pentru a pata myonucleii (Fig. 2d). La miotuburile tratate cu rGDF11 (− 15%, p = 0,0008) sau rMSTN (− 14%, p = 0,0013) comparativ cu martor netratat s-a observat o reducere a indicelui de diferențiere, care este definit ca proporția de mionuclei încorporate în miotuburi. Cu toate acestea, acest efect a fost estompat în MIOTUBURILE C2C12 care exprimă GDF11PRO-Fc tratate cu rGDF11 (- 1,9%; p = 0.0047, comparativ cu controlul tratat cu rgdf11) sau rMSTN (− 3,0%; p = 0,0040, comparativ cu controlul tratat cu rMSTN; Fig. 2e). În plus, miotuburile C2C12 care au fost tratate cu aav6-GDF11PRO-Fc au rezistat atrofiei miotuburilor induse de rgdf11 sau rMSTN. O scădere substanțială a diametrului mediu al miotubului în raport cu martor a fost detectată la miotuburile tratate cu rGDF11 (− 39%; 0,0002) sau rMSTN (− 35%; p = 0,0003) comparativ cu martor. Dimpotrivă, miotuburile care exprimă GDF11PRO-Fc tratate cu rGDF11 (−1,8%; p = 0,0005, comparativ cu controlul tratat cu rGDF11) sau rMSTN (- 5,3%; p = 0.0075, comparativ cu controlul tratat cu rMSTN) au fost în mare parte neafectate (Fig. 2f și g). Într-un experiment separat, GDF11PRO-Fc nu a reușit să prevină atrofia miotubului indusă de rActivin A, ceea ce este în concordanță cu observația că GDF11PRO-Fc nu leagă activina a (fișier suplimentar 1: Figura S3).

tratamentul cu rGDF11 sau rMSTN a fost, de asemenea, asociat cu o proporție mai mică de miotuburi maturi cu un număr mai mare de mionuclei, ceea ce sugerează o inhibare a diferențierii miotuburilor. Miotuburile cu mai mult de 11 mionuclei au cuprins doar 5,2% (p = 0,0215) și 7,2% (p = 0.0328) de miotuburi analizate în celule tratate cu rGDF11 și respectiv rMSTN. În comparație, miotuburile cu mai mult de 11 nuclee au constituit 26% din miotuburile analizate în miotuburile de control. În miotuburile care exprimă GDF11PRO-Fc care au fost tratate cu rGDF11 sau rMSTN, proporția miotuburilor cu mai mult de 11 mionuclei a fost de 22% (p = 0,0104, comparativ cu controlul tratat cu rGDF11) și respectiv 19% (p = 0,0404, comparativ cu controlul tratat cu rMSTN) (Fig. 2h). În cele din urmă, în acord cu ceea ce ar fi de așteptat după semnalizarea GDF11/MSTN la ActRII, o creștere a nivelurilor de proteine fosforilate SMAD2/3 (pSMAD2/3) în miotuburile tratate cu AAV6-EGFP și rGDF11 sau rMSTN a fost observabilă pe western blot 24 h după adăugarea ligandului (Fig. 2i). Această creștere a nivelurilor pSMAD2 / 3 a fost absentă la miotuburile tratate cu Aav6-GDF11PRO-Fc, sugerând că expresia GDF11PRO-Fc antagonizează activarea SMAD2/3 indusă de GDF11/MSTN în miotuburile diferențiate. În general, aceste rezultate indică faptul că GDF11PRO-Fc a fost capabil să prevină atrofia miotubului indusă de rgdf11 și rMSTN și inhibarea diferențierii în celulele C2C12.

expresia localizată GDF11PRO-Fc induce hipertrofia musculară scheletică la șoarecii adulți

anterior, am demonstrat că livrarea sistemică a genelor mediate de vectorul Aav a GDF11PRO-Fc la șoarecii neonatali a dus la o creștere semnificativă a ratei de creștere a mușchilor scheletici . Cu toate acestea, nu a fost clar din acest studiu dacă GDF11PRO-Fc pur și simplu a îmbunătățit creșterea mușchilor scheletici sau a indus efectiv hipertrofia mușchilor scheletici. În plus, nu a fost posibil să se determine dacă efectele GDF11PRO-Fc au fost mediate de blocarea locală a GDF11/MSTN în mușchii scheletici sau dacă efectele observate s-au datorat modulației sistemice a GDF11/MSTN. Pentru a aborda aceste întrebări, am evaluat impactul administrării intramusculare aav9-GDF11PRO-Fc la șoarecii adulți c57bl/6j. În aceste studii, a fost injectat doar partea posterioară din partea dreaptă, iar partea posterioară contralaterală din partea stângă a fost utilizată ca martor.

greutatea corporală a crescut ușor în timp la șoarecii tratați cu Aav9-GDF11PRO-Fc (+ 10% la 10 săptămâni; p = 0,0418; Fig. 3a). În plus, rezistența la prindere a unui singur membru posterior normalizată la greutatea corporală a fost semnificativ crescută la ambele membre testate individual, cu o magnitudine mai mare a efectului observată la membrele posterioare drepte tratate (+ 37%; p = 0,0177), deși a fost observată și o creștere semnificativă a rezistenței la prindere normalizate la membrele posterioare stângi netratate (+ 18%; p = 0,0426). Cu toate acestea, această diferență nu a atins semnificația atunci când ambele membre posterioare au fost testate simultan (+ 15%; p = 0,2375; Fig. 3b). La zece săptămâni după administrarea vectorului, membrele posterioare din partea dreaptă au fost vizibil mai mari la șoarecii tratați cu Aav9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3c). La șoarecii tratați cu AAV9-GDF11PRO-Fc, masa tisulară umedă a tibialului anterior din partea dreaptă injectat (+ 50%; p = 0,0046) și gastrocnemius (+ 37%; p = 0,0023) a fost semnificativ mai mare în comparație cu grupurile de control tratate cu vehicul. Nu a existat nicio diferență semnificativă statistic în masa țesutului umed al mușchilor membrelor posterioare stângi netratate (Fig. 3d). Analiza zonei Myofiber a relevat o creștere a zonei medii a secțiunii transversale myofiber (+15%; p = 0.0078) în aav9-GDF11PRO-Fc-injectat gastrocnemius pe partea dreaptă (Fig. 3e și f). Analiza distribuției MFD a relevat, de asemenea, o schimbare către miofibre mai mari în gastrocnemiul din partea dreaptă a șoarecilor injectați cu aav9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3G), indicând faptul că expresia localizată GDF11PRO-Fc a indus hipertrofia musculară. Într-o cohortă separată, am evaluat, de asemenea, impactul livrării genetice localizate a GDF11 printr-o injecție intramusculară de AAV9-GDF11 în partea posterioară dreaptă și s-a observat o atrofie musculară semnificativă la 10 săptămâni după tratament în partea posterioară injectată (fișier suplimentar 1: Figura S4).

GDF11PRO-Fc induce hipertrofia localizată a mușchilor scheletici după administrarea intramusculară a genelor. Șoarecii cu vârsta de 8 săptămâni C57BL / 6j au fost tratați cu AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 5) sau vehicul (n = 5) prin injecție intramusculară unilaterală în partea dreaptă a membrelor posterioare. Partea posterioară contralaterală din partea stângă nu a fost tratată. Șoarecii au fost eutanasiați la 10 săptămâni după tratament. o greutate corporală medie în timp. b puterea de prindere a membrelor posterioare s-a normalizat la greutatea corporală la 10 săptămâni după tratament. Sunt prezentate măsurători de la un singur membru posterior și ambele membre posterioare. c musculatura posterioară brută reprezentativă. Membrele posterioare injectate sunt desemnate cu o săgeată neagră. d greutatea țesutului umed al tibialis anterior și gastrocnemius. E imagini reprezentative de imunofluorescență ale secțiunilor transversale gastrocnemius injectate pe partea dreaptă colorate cu WGA conjugat AlexaFluor-488 pentru a vizualiza miofibrele. Barele de scară reprezintă 100 de metri cubi. f zona medie a secțiunii transversale a miofibrei în gastrocnemius din partea dreaptă injectată. g distribuția MFD Myofiber în gastrocnemius injectat pe partea dreaptă. Un minim de 500 de miofibre au fost măsurate pe șoarece. h identificarea Western blot a GDF11PRO-Fc în lizatele tisulare din probele de gastrocnemius și ficat injectate pe partea dreaptă a șoarecilor tratați. GDF11PRO-Fc nu a fost detectabil la șoarecii tratați cu vehicule. Încărcarea egală a proteinelor a fost verificată prin colorarea Ponceau S, iar GAPDH a fost utilizat ca control al încărcării. Toate barele de eroare reprezintă valoarea medie a sem. *p <0,05; **p< 0,01; n.S. nesemnificativ; comparativ cu controlul tratat de vehicul. TA tibialis anterior, gastrocnemius gaz

analiza Western blot a indicat că proteina GDF11PRO-Fc a fost exprimată în gastrocnemius din partea dreaptă injectată AAV9-GDF11PRO-Fc (banda 58 kDa; Fig. 3h). Cu toate acestea, GDF11PRO-Fc nu a fost detectabil în gastrocnemiul stâng netratat la aceeași cantitate totală de proteine încărcate, sugerând că majoritatea expresiei GDF11PRO-Fc a mușchilor scheletici a fost localizată în partea posterioară dreaptă injectată (datele nu sunt prezentate). GDF11PRO-Fc a fost, de asemenea, detectabil în ficat prin western blot, indicând faptul că a avut loc o anumită expunere sistemică (Fig. 3h). Această observație poate fi cel mai probabil atribuită scurgerii vasculare a vectorului AAV9 în circulația sistemică de la locul injectării . Din aceste date, determinăm că GDF11PRO-Fc induce hipertrofia musculară scheletică la șoarecii adulți. În plus, aceste efecte sunt cel puțin parțial mediate de blocarea locală a GDF11/MSTN asupra mușchilor scheletici, probabil prin inhibarea interacțiunilor ligandului cu ActRII asupra țesutului muscular scheletic.

livrarea sistemică a genei GDF11PRO-Fc crește masa și forța musculară scheletică la șoarecii mdx

în continuare, am evaluat impactul expresiei sistemice GDF11PRO-Fc la șoarecii mdx pentru a determina dacă GDF11PRO-Fc ar putea induce, de asemenea, hipertrofie și crește rezistența în mușchiul scheletic distrofic. În scopul acestui studiu, construcția GDF11PRO-Fc a fost modificată cu o mutație pentru a o face impermeabilă la clivajul metaloproteinazei endogene BMP1/TLD (GDF11PRO-Fc D122A) și pentru a crește persistența factorului în circulația sistemică . Pentru aceste experimente, atât aav9-GDF11PRO-Fc, cât și AAV9-GDF11PRO-Fc D122A au fost evaluate pentru a stabili dacă transgena d122a mutantă ar conduce la un efect mai pronunțat in vivo. Pentru a obține expresia sistemică, șoarecii mdx au fost tratați cu vector sau vehicul prin injectarea venei cozii. După administrarea intravenoasă, vectorul AAV9 transduce ficatul de șoarece cu eficiență ridicată. Hepatocitele transduse pot apoi să exprime transgena și să secrete produsul proteic în circulația sistemică .

începând cu 3 săptămâni după injectare, am observat o creștere semnificativă a greutății corporale care a persistat pe durata studiului cu aav9-GDF11PRO-Fc (+ 7,7% la 12 săptămâni; p = 0,0094) și aav9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 11% la 12 săptămâni; p = 0,006) tratament (Fig. 4a). Trebuie remarcat faptul că, datorită patologiei distrofice, șoarecii mdx prezintă de obicei hipertrofie musculară compensatorie, care poate masca parțial creșterea masei musculare indusă de expresia GDF11PRO-Fc. În ceea ce privește testele funcției musculare, șoarecii tratați au prezentat o rezistență crescută la prinderea membrelor anterioare, chiar și după normalizarea la greutatea corporală. Cu toate acestea, diferența de rezistență normalizată la prinderea membrelor anterioare a atins doar o semnificație statistică în grupul aav9-GDF11PRO-Fc D122A. La 12 săptămâni post-tratament, rezistența medie normalizată la prinderea membrelor anterioare a crescut cu + 28% (p = 0,0873) și + 36% (p = 0,0248) la șoarecii tratați cu Aav9-GDF11PRO-Fc și, respectiv, AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (Fig. 4b). Performanța Rotarod a fost, de asemenea, îmbunătățită prin tratamentul AAV9-GDF11PRO-Fc D122A în medie (+ 93% creștere a timpului de latență rotarod; p = 0,0127). Performanța Rotarod a fost, de asemenea, îmbunătățită în grupul Aav9-GDF11PRO-Fc, dar această diferență nu a atins semnificația statistică (+ 44% creștere a timpului de latență rotarod; p = 0,2835; Fig. 4c). Nu a fost observată nicio diferență în timpul de rulare a benzii de alergare în niciunul dintre grupuri (Fig. 4d).

GDF11PRO-Fc îmbunătățește rezistența la aderență și performanța rotarod la șoarecii mdx distrofici. Șoarecii mdx în vârstă de 6 săptămâni au fost tratați cu aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) sau vehicul (n = 7) prin injectarea venei posterioare. o greutate corporală medie în timp. b puterea de prindere a membrelor anterioare normalizată la greutatea corporală în timp. C cel mai bun timp până la căderea rotarod înregistrat de la pre-tratament (valoarea inițială) și 12 săptămâni post-tratament. Cel mai bun moment din trei încercări a fost folosit pentru analiză. d Distanța totală a alerga pe banda de alergare test de anduranță de la pre-tratament (valoarea inițială) și 12 săptămâni post-tratament. Toate barele de eroare reprezintă valoarea medie a sem. *p < 0,05; **p < 0,01; n.S. nesemnificativ; comparativ cu controlul tratat de vehicul

la sfârșitul perioadei de 12-studiul săptămânal, hipertrofia musculară a fost extrem de evidentă la șoarecii tratați (fig. 5a). Masele medii de țesut umed ale tibialului anterior, gastrocnemius și cvadriceps au fost crescute cu + 17% (p = 0,0472), + 20% (p = 0,0011) și + 14% (p = 0.0333), respectiv, în grupul Aav9-GDF11PRO-Fc. În grupul tratat cu aav9-GDF11PRO-Fc D122A, aceste valori au fost crescute în continuare la + 26% (p = 0,0030), + 31% (p = 0,0003) și + 23% (p = 0,0009) față de grupul de control tratat cu vehiculul pentru modificarea masei medii tibiale anterioare, a masei gastrocnemiene și, respectiv, a masei cvadriceps. În plus, masa țesutului umed cu diafragmă a fost crescută cu + 19% (p = 0,0162) și + 26% (p = 0,0014) în grupurile aav9-GDF11PRO-Fc și, respectiv, AAV9-GDF11PRO-Fc D122A. Interesant este că masa inimii nu a fost modificată semnificativ prin tratament. Aria medie a secțiunii transversale a miofibrei gastrocnemius a fost mai mare la șoarecii tratați cu Aav9-GDF11PRO-Fc (+ 23%; p = 0,0226) și Aav9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 25%; p = 0,0170; Fig. 5c și d). În analiza distribuției MFD, MFD a avut tendința de a atinge un vârf în jurul valorii de 20-30 centimetri în toate grupurile, ceea ce se datorează probabil proporției mai mari de miofibre regenerante mici în mușchiul distrofic. Cu toate acestea, tratamentul cu Aav9-GDF11PRO-Fc și AAV9-GDF11PRO-Fc D122A a dus la o proporție crescută de miofibre cu MFD-uri mai mari de 64 MMC, sugerând că expresia factorului a indus hipertrofia miofibrei (Fig. 5e) în mușchii scheletici.

GDF11PRO-Fc induce hipertrofia mușchilor scheletici la șoarecii mdx distrofici. Șoarecii mdx în vârstă de 6 săptămâni au fost tratați cu aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) sau vehicul (n = 7) prin injectarea venei posterioare. Șoarecii au fost eutanasiați la 12 săptămâni după tratament. o musculatură reprezentativă a membrelor posterioare brute. b greutatea țesutului umed al mușchilor membrelor, diafragmei și inimii. c imagini reprezentative de imunofluorescență ale secțiunilor transversale gastrocnemius colorate cu WGA conjugat AlexaFluor-488 pentru a vizualiza miofibrele. Barele de scară reprezintă 100 de metri cubi. d Zona medie a secțiunii transversale a miofibrei în gastrocnemius. e distribuția MFD Myofiber în gastrocnemius. Un minim de 500 de miofibre au fost măsurate pe șoarece. F identificarea GDF11PRO-Fc prin western blot în lizatul țesutului hepatic și serul șoarecilor tratați cu Aav9-GDF11PRO-Fc. Încărcarea egală a proteinelor a fost verificată prin colorarea Ponceau S, iar GAPDH a fost utilizat ca control al încărcării în lizatele țesutului hepatic. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; n.s. nesemnificativ; în comparație cu controlul tratat cu vehiculul

analiza Western Blot a confirmat expresia proteică a transgenelor în ficat și ser. Așa cum era de așteptat, banda de 58 kDa corespunzătoare GDF11PRO-Fc de lungime întreagă sau GDF11PRO-Fc D122A a fost detectabilă la șoarecii tratați. Nivelurile serice ale propeptidei de lungime completă au fost ușor mai mari la șoarecii tratați cu aav9-GDF11PRO-Fc D122A decât la cei tratați cu Aav9-GDF11PRO-Fc, sugerând că persistența serică a propeptidei active a fost crescută de mutația D122A (Fig. 5f).

În general, aceste rezultate indică expresia sistemică a GDF11PRO-Fc și GDF11PRO-Fc D122A crește masa musculară scheletică la șoarecii mdx distrofici și că această hipertrofie a mușchilor scheletici este asociată cu îmbunătățiri ale rezistenței la prindere și coordonării motorii. Cu toate acestea, tratamentul nu pare să afecteze rezistența musculară bazată pe performanța de alergare a benzii de alergare. În plus, mutantul D122A părea să fie puțin mai eficient în creșterea masei musculare și a funcției, probabil datorită persistenței serice îmbunătățite.

administrarea sistemică a genei GDF11PRO-Fc nu reduce patologia distrofică la șoarecii mdx

o serie de studii au raportat că blocarea semnalizării TGF-XV-ActRII-SMAD2 / 3, fie prin inhibarea MSTN, fie prin blocarea ActRII, poate avea beneficii terapeutice la modelele animale de DMD . Pentru a determina impactul tratamentului AAV9-GDF11PRO-Fc asupra patologiei distrofice, am efectuat analiza histologică a mușchilor membrelor și a diafragmei.

semnele caracteristice ale patologiei distrofice, incluzând necroza musculară, nucleația centrală, depunerea intramusculară de colagen și prezența infiltratelor inflamatorii au fost evidente la toate loturile mdx (Fig. 6a). În gastrocnemius, procentul zonei fibrotice a fost redus cu − 39% (p = 0,0273) la șoarecii tratați cu Aav9-GDF11PRO-Fc. Fibroza în gastrocnemius a fost, de asemenea, ușor scăzută în grupul AAV9-GDF11PRO-Fc D122A; cu toate acestea, datorită variabilității intersubiective ridicate a fibrozei intramusculare a mușchilor membrelor, această diferență nu a atins semnificația statistică (− 28%; p = 0,1230; Fig. 6b). De asemenea, nu s-a observat nicio diferență semnificativă în proporția miofibrelor nucleate Central, sugerând că regenerarea miofibrelor a avut loc activ în toate grupurile (Fig. 6c). Serul CK, un marker al descompunerii musculare, nu a fost, de asemenea, modificat semnificativ prin tratament (Fig. 6d). În plus, deteriorarea localizată a integrității membranei miofibre, măsurată prin colorarea imunofluorescenței IgG anti-șoarece, a fost evidentă în toate grupurile mdx. În mod neașteptat, șoarecii mdx tratați cu Aav9-GDF11PRO-Fc D122A au prezentat o ușoară creștere a zonei IgG-pozitive în medie, dar această diferență nu a atins semnificația statistică (+ 55%; p = 0,1729; Fig. 6e și f; fișier suplimentar 1: Figura S5). Semnele evidente ale necrozei miofibre, regenerării, nucleației centrale și penetranței IgG nu au fost evidente la gastrocnemius de tip sălbatic C57BL / 10J, indicând faptul că acești markeri sunt specifici patologiei distrofice (Fig. 6A-f; fișier suplimentar 1: Figura S5).

GDF11PRO-Fc nu atenuează patologia distrofică la șoarecii mdx. Șoarecii mdx în vârstă de 6 săptămâni au fost tratați cu aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) sau vehicul (n = 7) prin injectarea venei posterioare. Șoarecii cu potrivire de vârstă c57bl/10J (n = 5) au fost, de asemenea, incluși ca un control de tip sălbatic. Șoarecii au fost eutanasiați la 12 săptămâni după tratament. o colorare reprezentativă HE și MTC din secțiunile transversale gastrocnemius ale șoarecilor c57bl / 10J și mdx. Nucleația centrală este evidentă în toate grupurile mdx. Zonele localizate ale necrozei și regenerării miofibrelor sunt marcate cu o săgeată neagră. Zona fibrotică este reprezentată de regiunea albastră pe colorarea MTC. Barele de scală reprezintă 50 de Centimetre în secțiunile HE și 100 de Centimetre în secțiunile MTC. B zona fibrotică din gastrocnemius exprimată ca procent din suprafața totală a secțiunii transversale a mușchilor. c procentul de miofibre care prezintă nucleația centrală. D măsurarea nivelurilor circulante ale serului CK, un marker al leziunilor musculare. E imagini reprezentative de imunofluorescență ale colorării IgG de șoarece (roșu) în secțiunile transversale ale țesutului gastrocnemius. Colorarea pozitivă pentru IgG indică permeabilitatea miofibrei la proteinele serice și pierderea integrității membranei. Secțiunile au fost co-colorate cu WGA pentru a vizualiza miofibre individuale. Zona mărită este marcată cu o cutie albă. Miofibrele caracteristice IgG-pozitive sunt descrise cu o săgeată albă. Barele de scară reprezintă 100 de metri cubi. f zona miofibrelor IgG-pozitive exprimată ca procent din suprafața totală a secțiunii transversale a mușchilor. colorarea reprezentativă G he și MTC din secțiunile transversale ale diafragmei șoarecilor c57bl / 10J și mdx. Patologia extensivă este evidentă la șoarecii mdx, dar nu la șoarecii c57bl / 10J. Barele de scară reprezintă 100 de metri cubi. h zona fibrotică în diafragmă exprimată ca procent din suprafața totală a secțiunii transversale. *p < 0,05; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001; n. s. nesemnificativ; în comparație cu controalele mdx tratate cu vehicul

în diafragmă, h&e colorarea a evidențiat necroză extinsă și depunere intramusculară de colagen atât în grupurile mdx tratate, cât și în cele netratate (Fig. 6g). Similar cu ceea ce a fost observat în mușchiul gastrocnemius, tratamentul cu Aav9-GDF11PRO-Fc sau AAV9-GDF11PRO-Fc D122A a produs o reducere ușoară a fibrozei intramusculare a diafragmei în general. Procentul mediu al zonei fibrotice din diafragmă a fost redus cu 15% (p = 0,0328) și 17% (p = 0.019) cu tratament AAV9-GDF11PRO-Fc și respectiv aav9-GDF11PRO-Fc D122A (Fig. 6h). Așa cum era de așteptat, aceste caracteristici patologice au fost în mare parte absente în diafragma șoarecilor sălbatici de tip c57bl/10J (Fig. 6g și h). Din aceste date, determinăm că GDF11PRO-Fc și GDF11PRO-Fc D122A sunt capabili să inhibe ușor depunerea intramusculară de colagen în mușchii membrelor și diafragmă pe o perioadă de 3 luni. Cu toate acestea, tratamentul nu pare să oprească ciclul continuu de degenerare și regenerare musculară în gastrocnemius sau diafragma șoarecilor mdx adulți.