spectrofotometru de scanare cu un singur fascicul

există două clase majore de dispozitive: fascicul unic și fascicul dublu. Un spectrofotometru cu fascicul dublu compară intensitatea luminii între două căi de lumină, o cale care conține o probă de referință și cealaltă probă de testare. Un spectrofotometru cu un singur fascicul măsoară intensitatea relativă a luminii fasciculului înainte și după introducerea unei probe de testare. Deși măsurătorile de comparație de la instrumentele cu fascicul dublu sunt mai ușoare și mai stabile, instrumentele cu un singur fascicul pot avea o gamă dinamică mai mare și sunt optic mai simple și mai compacte. În plus, unele instrumente specializate, cum ar fi spectrofotometrele construite pe Microscoape sau telescoape, sunt instrumente cu un singur fascicul datorită caracterului practic.din punct de vedere istoric, spectrofotometrele folosesc un monocromator care conține o rețea de difracție pentru a produce spectrul analitic. Grilajul poate fi mobil sau fix. Dacă se utilizează un singur detector, cum ar fi un tub fotomultiplicator sau fotodiodă, grătarul poate fi scanat în trepte (spectrofotometru de scanare), astfel încât detectorul să poată măsura intensitatea luminii la fiecare lungime de undă (care va corespunde fiecărui „pas”). De asemenea, pot fi utilizate tablouri de detectoare (spectrofotometru matrice), cum ar fi dispozitive cuplate la Încărcare (CCD) sau tablouri fotodiode (PDA). În astfel de sisteme, grătarul este fix și intensitatea fiecărei lungimi de undă a luminii este măsurată de un detector diferit din matrice. În plus, majoritatea spectrofotometrelor moderne cu infraroșu Mediu utilizează o tehnică de transformare Fourier pentru a obține informațiile spectrale. Această tehnică se numește spectroscopie în infraroșu cu transformare Fourier.

la efectuarea măsurătorilor de transmisie, spectrofotometrul compară cantitativ fracțiunea de lumină care trece printr-o soluție de referință și o soluție de testare, apoi compară electronic intensitățile celor două semnale și calculează procentul de transmisie a eșantionului în comparație cu standardul de referință. Pentru măsurătorile de reflexie, spectrofotometrul compară cantitativ fracțiunea de lumină care reflectă din eșantioanele de referință și de testare. Lumina de la lampa sursă este trecută printr-un monocromator, care difractează lumina într-un „curcubeu” de lungimi de undă printr-o prismă rotativă și scoate lățimi de bandă înguste ale acestui spectru difractat printr-o fantă Mecanică pe partea de ieșire a monocromatorului. Aceste lățimi de bandă sunt transmise prin eșantionul de testare. Apoi densitatea fluxului de fotoni (wați pe metru pătrat de obicei) a luminii transmise sau reflectate este măsurată cu o fotodiodă, dispozitiv cuplat la încărcare sau alt senzor de lumină. Valoarea transmitanței sau a reflectanței pentru fiecare lungime de undă a eșantionului de testare este apoi comparată cu valorile transmisiei sau ale reflectanței din eșantionul de referință. Majoritatea instrumentelor vor aplica o funcție logaritmică raportului de transmisie liniară pentru a calcula ‘absorbția’ eșantionului, o valoare proporțională cu ‘concentrația’ substanței chimice măsurate.

pe scurt, secvența evenimentelor dintr-un spectrofotometru de scanare este următoarea:

1. sursa de lumină este strălucită într-un monocromator, difractată într-un curcubeu și împărțită în două fascicule. Acesta este apoi scanat prin eșantion și soluțiile de referință.
2. fracțiunile lungimilor de undă incidente sunt transmise prin sau reflectate din eșantion și referință.
3. lumina rezultată lovește dispozitivul fotodetector, care compară intensitatea relativă a celor două fascicule.
4. circuitele electronice convertesc curenții relativi în procente de transmisie liniară și/sau valori de absorbție / concentrație.

într-un spectrofotometru matrice, secvența este după cum urmează:

1. sursa de lumină este strălucită în eșantion și focalizată într-o fantă
2. lumina transmisă este refractată într-un curcubeu cu grătarul de reflexie
3. lumina rezultată lovește dispozitivul fotodetector care compară intensitatea fasciculului
4. circuitele electronice transformă curenții relativi în procente de transmisie liniară și/sau valori de absorbție/concentrație

multe spectrofotometre mai vechi trebuie calibrate printr-o procedură cunoscută sub numele de „zero”, pentru a echilibra ieșirea curentă nulă a celor două fascicule de la detector. Transmiterea unei substanțe de referință este stabilită ca valoare de referință (dată), astfel încât transmiterea tuturor celorlalte substanțe sunt înregistrate în raport cu substanța inițială „zero”. Spectrofotometrul transformă apoi raportul de transmisie în’ absorbție’, concentrația componentelor specifice ale probei de testare în raport cu substanța inițială.

aplicații în biochimie

spectrofotometria este o tehnică importantă utilizată în multe experimente biochimice care implică izolarea ADN, ARN și proteine, cinetica enzimatică și analize biochimice. Deoarece probele din aceste aplicații nu sunt ușor disponibile în cantități mari, acestea sunt potrivite în special pentru a fi analizate în această tehnică nedistructivă. În plus, proba prețioase pot fi salvate prin utilizarea unei platforme de micro-volum în cazul în care cât mai puțin 1UL de probă este necesară pentru analize complete. O scurtă explicație a procedurii de spectrofotometrie include compararea absorbției unei probe goale care nu conține un compus colorat cu o probă care conține un compus colorat. Această colorare poate fi realizată fie printr-un colorant, cum ar fi colorantul Coomazie Brilliant Blue g-250, măsurat la 595 nm, fie printr-o reacție enzimatică, așa cum se vede între galactozidază și onpg (transformă proba galbenă) măsurată la 420 nm.: 21-119 spectrofotometrul este utilizat pentru măsurarea compușilor colorați în regiunea vizibilă a luminii (între 350 nm și 800 nm),:65 astfel poate fi utilizat pentru a găsi mai multe informații despre substanța studiată. În experimentele biochimice, se alege o proprietate chimică și / sau fizică, iar procedura utilizată este specifică acelei proprietăți pentru a obține mai multe informații despre eșantion, cum ar fi cantitatea, puritatea, activitatea enzimei etc. Spectrofotometria poate fi utilizată pentru o serie de tehnici, cum ar fi determinarea absorbanței optime a lungimii de undă a probelor, determinarea pH-ului optim pentru absorbanța probelor, determinarea concentrațiilor de probe necunoscute și determinarea pKa a diferitelor probe.:21-119 spectrofotometria este, de asemenea, un proces util pentru purificarea proteinelor și poate fi, de asemenea, utilizat ca metodă pentru a crea teste optice ale unui compus. Datele spectrofotometrice pot fi, de asemenea , utilizate împreună cu ecuația Beer-Lambert, a = − log 10 t = log C L = O D {\textstyle a=-\log _{10}T=\epsilon cl=OD}

, în pentru a determina diferite relații între transmisie și concentrare, și absorbanță și concentrare.:21-119 deoarece un spectrofotometru măsoară lungimea de undă a unui compus prin culoarea sa, se poate adăuga o substanță de legare a colorantului, astfel încât să poată suferi o schimbare de culoare și să fie măsurată. Este posibil să se cunoască concentrațiile unui amestec cu două componente folosind spectrele de absorbție ale soluțiilor standard ale fiecărui component. Pentru a face acest lucru, este necesar să se cunoască coeficientul de extincție al acestui amestec la două lungimi de undă și coeficienții de extincție ai soluțiilor care conțin greutățile cunoscute ale celor două componente. Spectrofotometrele au fost dezvoltate și îmbunătățite de-a lungul deceniilor și au fost utilizate pe scară largă în rândul chimiștilor. În plus, Spectrofotometrele sunt specializate pentru a măsura valorile de absorbție a lungimii de undă a luminii UV sau vizibile.: 21-119 este considerat a fi un instrument foarte precis, care este, de asemenea, foarte sensibil și, prin urmare, extrem de precis, în special în determinarea schimbării culorii. Această metodă este, de asemenea, convenabilă pentru utilizarea în experimentele de laborator, deoarece este un proces ieftin și relativ simplu.