faza mobilă

faza mobilă în cromatografia în fază inversată este un amestec de apă sau tampon cu un solvent organic polar, cum ar fi metanol, acetonitril, izopropanol (IPA) sau tetrahidrofuran (THF). Puterea de eluție crește aproximativ în această ordine. Alcoolii sunt donatori de protoni, în timp ce acetonitrilul este un acceptor de protoni. Amestecurile acetonitril / apă au o vâscozitate mai mică în comparație cu amestecurile celorlalți solvenți cu apă. Acest lucru duce la o contrapresiune mai mică. Amestecurile IPA / apă au cea mai mare vâscozitate. Datorită contrapresiunii mai mici care rezultă din vâscozitatea mai mică, cei doi modificatori organici de fază mobilă mai frecvent utilizați sunt acetonitrilul și metanolul. De asemenea, acetonitrilul are o absorbție scăzută în UV scăzut, mult mai puțin decât ceilalți solvenți.

apa este cel mai slab eluent din cromatografia în fază inversă. Adăugarea de metanol sau acetonitril reduce retenția. Logaritmul factorului de retenție scade aproximativ proporțional cu concentrația solventului organic. Dacă analitul este o moleculă mică, așa cum este cazul majorității produselor farmaceutice, retenția va scădea aproximativ de șapte ori atunci când concentrația de metanol în faza mobilă crește cu aproximativ 20%. În multe circumstanțe (de exemplu, în dezvoltarea metodei), se presupune că există o relație liniară între logaritmul factorului de retenție și fracția de volum a modificatorului organic în faza mobilă. Cu toate acestea, ar trebui să considerăm acest lucru doar ca o regulă bună, care nu este nici exactă, nici justificată teoretic.

datorită proprietăților de solvatare ale acetonitrilului comparativ cu metanolul, înlocuirea unui solvent cu celălalt duce adesea la o modificare a ordinii de eluție a analiților (Figura 2). Prin urmare, această tehnică este frecvent utilizată în dezvoltarea metodei. Schimbarea de la un modificator la altul creează modificări de selectivitate mai semnificative decât schimbarea rezistenței solventului singur (adică prin schimbarea pur și simplu a concentrației solventului organic). THF modifică, De asemenea, selectivitatea drastic. De fapt, cele mai mari modificări de selectivitate sunt adesea cauzate de înlocuirea unor metanol sau acetonitril cu THF. Cu toate acestea, din mai multe motive, cum ar fi mirosul neplăcut, formarea de peroxizi și transparența UV nefavorabilă, nu este folosit foarte des.

Figura 2. Influența modificatorului de fază mobilă asupra selectivității separării. Sus, acetonitril; jos, metanol. Coloana: Xterra RP18, 4,6 mm, 50 mm, 3,5 mm. Gradient la 2 ml min-1 peste 15 min de la 0 la 80% organic la pH 3 cu formiat de amoniu. Analiți: 1, triamteren; 2, clortalidonă; 3, althiazidă; 4, furosemid; 5, benztiazidă; 6, probenecid; 7, acid etacrinic; 8, bumetanidă; 9, acid canrenoic. (Cromatograma furnizată de Diane Diehl și Kim Tran, Waters Corporation.)

interpretarea selectivității solventului este complicată de faptul că solventul organic este adsorbit de liganzii fazei staționare și poate fi considerat ca făcând parte din faza staționară. Recent, mai mulți autori au măsurat excesul de suprafață al modificatorilor organici pentru fazele staționare standard de tip C18 și au găsit diferențe semnificative în solvatarea suprafeței dintre acetonitril și metanol.

s-a menționat la începutul acestei secțiuni că metanolul asigură o retenție mai mare decât acetonitrilul. Acest lucru este și mai pronunțat pentru compușii ionizați decât pentru compușii neionizați. Acest lucru are sens din punctul de vedere că metanolul adsorbit în faza staționară facilitează pătrunderea moleculelor ionizate în faza staționară. Același model se găsește atunci când metanolul este comparat cu THF. Acestea sunt caracteristici utile în dezvoltarea metodei. Pe de altă parte, compușii cu grupări funcționale sulfonamide prezintă o retenție relativ mai mare în THF, în comparație cu un grup de analiți de referință. În general, se poate observa o influență semnificativă a solventului organic asupra selectivității unei separări, dar o raționalizare este dificilă, deoarece solventul poate fi găsit atât în faza staționară, cât și în cea mobilă. Unii autori au încercat, de asemenea, să distingă fazele mobile cu conținut ridicat de apă de cele cu conținut scăzut de apă.așa cum am menționat mai sus, diferențele importante de selectivitate dintre diferiții solvenți sunt un instrument foarte util în dezvoltarea separărilor de fază inversată. Schemele clasice de dezvoltare a metodei au folosit metanol, acetonitril, și THF ca modificatori organici în faza mobilă. Selectivitățile intermediare pot fi obținute cu amestecuri de solvenți, iar o ajustare a distanței de vârf poate fi realizată fără dificultate. Schemele moderne de dezvoltare a metodelor folosesc temperatura ca o altă variabilă ușor controlabilă în ajustarea selectivității.

un aspect important al selectivității fazei mobile este pH-ul său. controlul reținerii compușilor ionizabili cu ajutorul tampoanelor sau aditivilor acizi sau bazici la faza mobilă este foarte important. Prin alegerea judicioasă a pH-ului fazei mobile, se poate facilita manipularea retenției și selectivității. După cum sa menționat mai sus, diferența de retenție între forma ionizată și cea neionizată a unui analit poate fi de 10 până la 30 de ori, iar controlul pH – ului este important.

în ultimii ani, cercetările au arătat că atât pH-ul, cât și constantele de ionizare ale tamponului sunt modificate, atunci când se adaugă solvenți organici. Acest lucru are consecințe importante pentru controlul reținerii. De obicei, se poate ajunge la o ionizare definită a analitului dacă pH-ul fazei mobile este la 2 unități de pH distanță de pKa a analitului. Dar dacă pH-ul și analitul pKa se schimbă odată cu adăugarea de solvent organic, acest lucru nu este ușor de rezolvat folosind reguli simple. Prin urmare, un bun control al pH-ului și un tampon bun sunt elemente importante ale reproductibilității unei separări de fază inversată a analiților ionizabili. PH-ul este măsurat în apă, unde cineva este familiarizat cu valorile PKA ale tampoanelor utilizate în mod obișnuit și preferă să rămână aproape de aceste valori pKa. Capacitatea maximă a tamponului se găsește la PKA a tamponului. În timp ce pH-ul se modifică în prezența solventului organic, capacitatea tampon nu. Pentru practicianul cromatografiei în fază inversă, acesta este un aspect important al controlului retenției. Pe de altă parte, investigatorul mecanismelor de retenție în fază inversă trebuie să fie pregătit pentru a măsura pH-ul în prezența solventului organic pentru a înțelege pe deplin influența acestuia asupra retenției. De obicei, adăugarea solventului organic are ca rezultat o creștere a PKA a acizilor și o scădere a pKa pentru baze. Acest lucru se aplică atât tampoanelor, cât și analiților. Acest lucru poate duce la o schimbare semnificativă a modelului de ionizare așteptat al unui analit. Iată un exemplu care ilustrează acest lucru: o amină cu un pKa de 9 este complet ionizată într-un tampon fosfat la pH 7 în apă, dar poate fi ionizată doar pe jumătate în același tampon după adăugarea a 70% metanol. Este clar că astfel de efecte sunt semnificative. Prin urmare, o modalitate precisă de a pregăti un tampon și de a controla pH-ul acestuia este vitală pentru un bun control al retenției de fază inversată a analiților ionizabili.

alte interacțiuni ionice afectează retenția și selectivitatea unei separări de fază inversată a analiților ionizați. Un instrument clasic pentru creșterea retenției analiților ionici este cromatografia perechilor de ioni. În această tehnică, faza staționară este echilibrată cu un ion încărcat hidrofob, cum ar fi un ion de acid sulfonic cu lanț lung (de exemplu, octilsulfonat) sau o amină cuaternară hidrofobă (de exemplu, ionul tetrabutilamoniu). O concentrație tipică de fază mobilă este de aproximativ 10 mM. adăugarea reactivului pereche de ioni la faza mobilă crește retenția ionilor țintă, scade retenția ionilor cu aceeași sarcină ca reactivul pereche de ioni și lasă retenția analiților neutri, inclusiv zwitterionii, aproape neafectată. Astfel, este un instrument excelent pentru a regla selectivitatea unei separări. Motivul acestor modificări ale selectivității este faptul că reactivul pereche de ioni este adsorbit pe suprafața fazei staționare. Cea mai simplă interpretare a mecanismului de retenție rezultat este o combinație a schimbului de ioni cu mecanismul fazei inversate. Pe măsură ce concentrația reactivului pereche de ioni în faza mobilă crește, retenția analiților încărcați opus crește inițial și apoi se nivelează la concentrații mai mari. Pentru reactivii cu perechi de ioni cu lungime diferită a lanțului, retenția crește mai rapid cu o lungime mai mare a lanțului.

un alt efect de interacțiune Ionică întâlnit cu analiții cationici este creșterea retenției atunci când se adaugă mici ioni anorganici în faza mobilă. Concentrațiile necesare sunt de obicei de aproximativ 10 ori mai mari decât concentrațiile utilizate cu reactivi cu perechi de ioni. Anionii tipici de acest tip sunt perclorat (ClO4−), tetrafluoroborat (BF4−) sau hexafluorofosfat (PF6−). Acestea cresc semnificativ retenția analiților cationici. Efectul este mai pronunțat cu acetonitrilul ca aditiv în fază mobilă decât cu metanolul. Acest lucru se explică printr-un strat mai gros de acetonitril adsorbit pe faza staționară comparativ cu un strat monomolecular de metanol și împărțirea contraionului în acest strat. Din punctul de vedere al utilizatorilor, comportamentul de retenție al analiților cationici în prezența acestor anioni anorganici nu este diferit de cel observat cu reactivi cu perechi ionice adevărate, adică cu acizi sulfonici cu lanț lung.