diagnostic

diagnostic clinic: tabloul clinic al pacienților care suferă de infecție cu chlamydia ar putea fi înșelătoare ca până la 70-80 la suta din femeile infectate și 50 la suta din Barbatii infectati sunt asimptomatice. De obicei, o femeie cu infecție chlamydială necomplicată va prezenta secreții vaginale inodore, mucoide, fără prurit. Disuria fără frecvență sau urgență se va plânge dacă este implicată uretra. Mai mult, în PID, pot fi provocate antecedente de dureri abdominale severe cu febră mare, dispareunie, cicluri menstruale prelungite și sângerări intermensturale. La examinare, cervicita cu descărcare mucoidă galbenă, tulbure, poate fi văzută din os. Cervixul tinde să sângereze ușor atunci când este răzuit cu spatulă sau perie. Analiza urinei va dezvălui prezența > 5 WBC/HPF (câmp de putere mare), care sugerează uretrita13. Infecțiile cu chlamydia nu pot fi distinse Clinic de alte infecții uretrale. Testul aminei (i. e., eliberarea semnificativă a mirosului la adăugarea KOH la secreția vaginală) poate ajuta la diferențierea infecțiilor chlamydiene de alte infecții ale tractului genital inferior, dar are o specificitate scăzută.

infecția cu Chlamydia la bărbați se manifestă ca uretrită în 15-55% din persoanele afectate mai puțin sau egal cu 35 de ani, ocazional epididimita poate fi văzută2. Descărcarea uretrală ușoară până la moderată, clară până la albă, se observă dimineața înainte de golurile pacientului. În epididimită, pot fi provocate antecedente de durere testiculară unilaterală cu eritem scrotal, sensibilitate sau umflare peste epididim. Diagnosticul poate fi stabilit prin prezența descărcării mucopurulente din penis care pe colorarea Gram arată >5 WBC/HPF și absența diplococilor gram negativi intracelulari. Sindromul Reiter poate fi o complicație rară a infecției cu chlamydia netratată. O artrită reactivă care include triada uretritei / cervicitei la femei, conjuntivită și Erupție mucopurulentă nedureroasă pe palme și tălpi de picioare este observată în sindromul Reiter29. Femeile sunt mai frecvent afectate decât bărbații. Există implicări asimetrice multiple ale articulațiilor cu predilecție pentru extremitățile inferioare.

diagnosticul de laborator: natura asimptomatică a bolii și spectrul tot mai mare de infecții cauzate de C. trachomatis subliniază necesitatea metodelor de laborator sensibile și fiabile.

competența în colectarea și transportul probelor este esențială pentru acuratețea testelor de diagnosticare. Atât sensibilitatea, cât și specificitatea testelor de diagnostic pentru C. trachomatis s-au dovedit a fi direct legate de adecvarea specimenului. Celulele gazdă care adăpostesc organismul ar trebui incluse în colectarea probelor, deoarece chlamydiae sunt agenți patogeni intracelulari obligați, în special în tehnicile care implică vizualizarea directă a organismului.

alegerea locurilor de prelevare poate influența probabilitatea recuperării agentului patogen. S-a observat o creștere cu 10-20% a recuperării C. trachomatis din tractul genital dacă se prelevează atât probe cervicale, cât și uretrale, în comparație cu prelevarea de probe cervicale numai42. Tamponul Endocervical, tamponul vaginal / introital, tamponul vulvar, precum și tamponul uretral și rectal și prima captură de urină sunt probele obișnuite prelevate de la pacientele de sex feminin. Tamponul uretral și rectal și prima probă de urină pot fi, de asemenea, colectate de la pacienții de sex masculin, pe lângă alte probe specifice, cum ar fi lichidul prostatic.

asigurarea calității colectării și transportului specimenului: adecvarea specimenului poate fi determinată prin vizualizarea celulelor squamo-columnare în timpul microscopiei. Un specimen este considerat adecvat dacă conține o celulă coloană / metaplastică pe diapozitiv. Probabilitatea de izolare este optimizată dacă epruveta este refrigerată imediat după colectare la 2-8 centimetri C. În mod ideal, timpul dintre colectarea eșantionului și prelucrare ar trebui să fie mai mic de 48 h, dacă acest lucru nu este posibil, acestea pot fi înghețate la -70 centimetri C până la procesare16. Serul fetal bovin (2-5%) ajută la menținerea viabilității chlamydiae în specimen, care urmează să fie congelată. Fosfatul de zaharoză cu doi molari (2-MSP) sau fosfatul de glutamat de zaharoză sunt mediul de transport cel mai frecvent utilizat. Medii de transport sintetice pentru Cultură și unele teste non-cultură au fost dezvoltate și aprobate pentru utilizare diagnostică, adică mediu de transport M4, Mediu Flex Trans și nou mediu sintetic/universal M4.

diagnosticul de laborator al chlamidiei constă în următoarele metode:

(i) teste specifice

cultura celulară: izolarea organismului este metoda definitivă pentru diagnosticarea infecției cu chlamydia. Chlamydia este un agent patogen intracelular obligatoriu și, prin urmare, necesită ou de găină embrionat sau linii celulare animale pentru Cultură. Astfel de metode de cultură sunt dificile din punct de vedere tehnic, necesită multă muncă, greoaie și costisitoare și nu au fost adoptate pe scară largă ca un test de rutină efectuat în laboratoarele clinice generale. Cu toate acestea, trei sisteme in vitro au fost utilizate pentru cultura chlamydiae și anume. inoculare de șoarece (intraperitoneală, intracraniană și intravenoasă), inoculare de sac de gălbenuș (inoculare de sac de gălbenuș de pui de 7-8 zile) și linii de cultură celulară16. Cele mai frecvent utilizate linii celulare includ – celulele HeLa 229, celulele McCoy, celulele BHK21 și bgmk24.

sensibilitatea culturii celulare pentru izolarea chlamydiae este sporită prin pretratarea celulei prin policații, DEAE-dextrani, centrifugarea inoculului pe monostratul celular și încorporarea anti-metaboliților cum ar fi cicloheximida sau citochalasina B în mediul de cultură celulară42. Monostratul celular pentru cultura C. trachomatis este cultivat în flacoane cu tambur sau coajă pe capace de sticlă sau în puțurile vaselor de cultură celulară multiwell. Metoda flaconului shell este mai sensibilă pentru specimenul clinic decât cultura de celule multiwell, datorită șanselor mai mici de contaminare încrucișată42. Înainte de inoculare, specimenul trebuie sonicat pentru a perturba celulele gazdă și pentru a separa incluziunile chlamydiale. Pentru a inocula culturile celulare, mediul de cultură suprapus trebuie îndepărtat și înlocuit cu suficient specimen în mediul de transport al culturii pentru a acoperi monostratul și a preveni uscarea.

cel mai frecvent utilizat mediu de creștere este Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) suplimentat cu aminoacizi și vitamine, ser fetal de vițel (5-10), glucoză suplimentară (0,056 m) și 2-glutamină42. După inoculare, culturile sunt incubate la 37o C timp de 2-3 zile. Incluziunile chlamydiale sunt apoi observate prin colorarea imunofluorescentă. S-a demonstrat că sensibilitatea izolației variază între 70-85% în funcție de laborator și de sistemul de cultură utilizat. În mod tradițional, acesta este „standardul de aur” pentru diagnosticul de C. trachomatis, deoarece este 100% specific42. Din păcate, aceasta depășește capacitățile majorității laboratoarelor private și publice datorită cererii sale tehnice, intensității forței de muncă și costului ridicat.

Test fluorescent Direct (DFA): Testul DFA adaugă avantajul considerabil al colorării anticorpilor specifici chlamidiei la examinarea directă a specimenului și rămâne una dintre cele mai utile tehnici de diagnostic. În acest test, se utilizează identificarea rapidă a corpurilor elementare în frotiuri cu anticorpi monoclonali conjugați cu izotiocin (FITC – Mab) împotriva MOMP sau LPS specifice genului. Corpurile elementare apar ca particule distincte, conturate brusc, verde măr, în formă de disc (300 nm) și corpurile reticulate apar de aproximativ trei ori mai mari decât corpurile elementare având un halou fluorescent.

această procedură nu necesită condiții stricte pentru transportul probelor, deoarece un frotiu lateral al patului este pregătit și ulterior transportat pentru prelucrare. Cu utilizarea MOMP de C. trachomatis, sensibilitatea și specificitatea DFA se constată a fi de 80-90% și, respectiv, 98-99% în raport cu cultura43. Specificitatea ridicată a DFA este atribuită dependenței sale de vizualizarea morfologiei distinctive și a caracteristicilor de colorare ale incluziunilor chlamydiale. DFA este singurul test de diagnostic disponibil care permite evaluarea simultană a adecvării specimenului prin vizualizarea celulelor epiteliale prezente în frotiu. Este rapid și simplu (timp de răspuns aproximativ 30 min), dar examinarea microscopică și interpretarea rezultatelor necesită expertiză. Prin urmare, această metodă este recomandată pentru laboratoarele cu volum redus. Acest test poate fi aplicat și site-urilor extragenitale. Se raportează că este mai sensibil decât cultura pentru detectarea chlamidiei în specimenele endometriale sau tubare42.

ELISA (test imunosorbant legat de enzime): ELISA este disponibil pentru detectarea antigenului C. trachomatis. Mai multe kituri Elisa disponibile în comerț sunt disponibile în acest scop. Cele mai multe dintre acestea detectează LPS chlamydial, care este mai solubil decât MOMP. Testele imunoenzimatice (EIA) au fost raportate ca având o sensibilitate de 62-96% și o specificitate de 86-99% în comparație cu cultura celulară44. Acest test este potrivit pentru laboratoarele fără acces la cultura celulară. Cu toate acestea,diferite studii mari și mici din întreaga lume,inclusiv India, au raportat o sensibilitate slabă a ELISA în comparație cu DFA și PCR45, 46, 47.

citologie: citologia este un test de diagnostic ușor disponibil, simplu de utilizat și rentabil. Nu necesită precauții pentru depozitarea și transportul probelor și pot fi detectate și particule neviabile/neinfecțioase. Calitatea specimenului clinic poate fi evaluată prin tehnica microscopică, iar procedurile tehnice utilizate în aceste teste sunt de obicei mai rapide și mai simple de efectuat decât cultura. Giemsa, imunoflorescența și metodele de colorare cu iod sunt cele mai frecvent utilizate. Alte pete precum immunoperoxidase, immunoferritin, May Grunwald, Giemenez, Macchiavello și acridine orange pot fi, de asemenea, utilizate pentru detectarea incluziunii chlamydiale în celulele exfoliate. Prezența incluziunilor intracitoplasmatice este patogonomică pentru infecțiile oculare chlamydiene la nou-născuți, cu toate acestea, această metodă nu este recomandată pentru diagnosticarea conjunctivitei sau a infecției genitale la adulți din cauza lipsei de sensibilitate. Dintre cele trei metode, imunofluorescența oferă cea mai mare sensibilitate urmată de Giemsa și apoi colorarea iodului42.

metode moleculare: Metodele tradiționale de diagnostic au mai multe limitări care includ sensibilitate scăzută, timp de testare lung și costuri ridicate. Prin urmare, sunt concepute teste bazate pe recunoașterea directă a secvențelor ADN și ARN. Sonda ADN disponibilă în comerț pentru detectarea chlamidiei este testul PACE 2 (Probe Assay Chemiluminescence Enhanced)48, capabilă să detecteze și Neisseria gonorrhoeae, care este o sondă ADN non-izotopică pentru detectarea părților specifice ale R-ARN de C. trachomatis în specimenul endocervical și uretral. O altă sondă ADN, testul PACE 2C a fost, de asemenea, dezvoltat, care detectează simultan atât C. trachomatis, cât și N. gonorrhoeae dintr-un singur specimen; cu toate acestea, este necesară o evaluare suplimentară a PACE 2c înainte de utilizarea sa în diagnosticare. Aceste teste folosesc o sondă ADN chemiluminescentă care hibridizează la o secvență specifică speciei de ARNr 16S chlamydial. Odată ce se formează hibridul ADN-ARNr, acesta este adsorbit pe o perlă magnetică și răspunsul chemiluminescent este detectat cantitativ cu un luminometru. Deoarece divizarea activă a chlamydiae conține până la 104 copii ale ARNr 16S, testul PACE 2 ar trebui să fie teoretic mai sensibil decât sistemele de detectare a antigenului. Sensibilitatea APCE 2 în raport cu un standard de amplificare ADN nu a fost încă bine evaluată, dar a fost raportată a fi de 77 până la 93% 48 într-un studiu.

dezvoltarea testelor bazate pe tehnologia de amplificare a acidului nucleic (NAAT) a fost cea mai importantă avansare în domeniul diagnosticului chlamydial, deoarece tehnicile de cultură celulară in vitro au înlocuit sacul de gălbenuș pentru cultura și izolarea organismului de probele clinice. NAAT este cu cel puțin 20-30% mai sensibil (capabil să detecteze doar o singură copie genică) și 100% specific49,50. Oferă posibilitatea de a utiliza probe neinvazive, cum ar fi urina, pentru a examina infecțiile la persoanele asimptomatice care nu ar căuta în mod obișnuit îngrijiri clinice. Acesta este un avantaj critic, deoarece majoritatea infecțiilor cu chlamydia la femei și o proporție semnificativă de infecții la bărbați sunt asimptomatice. Cea mai cunoscută dintre tehnologiile de amplificare a ADN-ului este PCR. PCR poate fi specific genului, speciei, grupului sau tulpinii, în funcție de designul grundului. Genele vizate pentru diagnosticarea C. trachomatis sunt gena MOMP, plasmida endogenă, gena fosfolipazei și gena ARNr 16S și 23S. Deoarece toate tehnologiile de amplificare a acidului nucleic detectează ținte de acid nucleic, acestea nu depind nici de viabilitate, nici de o stare intactă a organismului țintă pentru un rezultat pozitiv. Prin urmare, transportul eșantionului nu este o problemă critică49. Deși nu a fost bine studiat,” fereastra ” pentru starea de cultură negativă, PCR pozitivă după terapia cu doxiciclină pare să dureze până la 3 wk29. După acest timp, specimenele pacientului devin atât cultură, cât și PCR negative.

testul PCR pentru detectarea C. trachomatis dezvoltat de Roche Diagnostics, Basel Elveția (Roche-Amplicor) a fost primul test PCR aprobat de FDA în Statele Unite51. Din 1993, Amplicor PCR a fost relativ bine evaluat atât pentru probele urogenitale, cât și pentru cele urinare, cu o sensibilitate și specificitate generală de 90 și 99 până la 100%, respectiv51. Amplicor PCR este aprobat pentru specimene de urină cervicală, masculină uretrală și masculină.

cu explozia tehnicilor de biologie moleculară teste mai noi, cum ar fi sistemul M2000 (Abbott), precum și amplificarea strand-deplasare (SDA) (bd probetec strand deplasare amplificare dezvoltat de Becton Dickinson and Company, sisteme de diagnosticare, Franklin Lakes, N. J.) și amplificare mediată de transcriere (TMA) (sistemul APTIMA de Gen-Probe, Inc., San Diego) a devenit disponibil pentru C. trachomatis. Deși populare în țările dezvoltate, costul lor inițial ridicat și de întreținere împiedică utilizarea lor în Setări sărace în resurse.

povara lui C. organismele trachomatis din tractul genital (sarcina chlamydială) pot fi detectate prin PCR cantitativ în timp real și pot varia de la 10 la peste un milion de organisme/ml de secreții ale tractului genital52. Acest lucru este probabil să influențeze performanța diferitelor teste de amplificare a acidului nucleic, care nu disting în mod obișnuit între persoanele cu sarcini clamidiale ridicate și scăzute. S-a raportat că diferențele în sarcina chlamydială sunt asociate cu prezența simptomelor clinice, cu transmisibilitatea și persistența infecției și cu riscul de apariție a sechelelor cronice53. Prin urmare, există un rol critic al cuantificării în diagnosticul și tratamentul infecțiilor cu chlamydia.

NAATs sunt cele mai sensibile teste pentru screeningul și diagnosticul infecțiilor chlamydiene și gonococice ale tractului genital54,55,56. Cu toate acestea,sunt raportate îndoieli cu privire la performanța lor în zonele cu prevalență scăzută57, 58. În 2002, CDC a recomandat confirmarea tuturor Naat-urilor pozitive pentru C. trachomatis atunci când valoarea predictivă pozitivă a testului este <90% 59. Cu toate acestea,adevăratele specificități ale metodelor NAAT se dovedesc a fi >99% 54, 55.

CDC a sugerat, de asemenea, mai multe strategii posibile de confirmare59, care includ (i) testarea unui al doilea specimen cu un NAAT diferit având o sensibilitate egală sau mai mare la primul test, (ii) efectuarea unui NAAT diferit având o sensibilitate egală sau mai mare la primul test care vizează o secvență de acid nucleic diferită pe specimenul original, (iii) repetarea testului original pe specimenul original și (iv) aducerea pacientului înapoi pentru o retestare.cu toate acestea, limitările descrise sunt că majoritatea clinicienilor nu vor colecta două probe pentru aceeași evaluare și nici nu este posibil să aducă înapoi pacientul pentru a colecta un alt eșantion, iar majoritatea laboratoarelor nu au facilitățile / capacitatea de a efectua două NAATs diferite.

conceptul de testare de confirmare nu este nou57. Cu toate acestea; complică manipularea unui eșantion pozitiv NAAT și adaugă costuri unui test de screening deja scump. De asemenea, există încă loc pentru îmbunătățirea sensibilității NAATs, poate printr-o mai bună pregătire a specimenelor, automatizare sau concentrare țintă.

(ii) teste nespecifice

testul esterazei leucocitare (LE) este un test rapid de jojă pentru utilizarea cu probe de urină. Acest test este conceput pentru a detecta infecțiile tractului urinar prin detectarea enzimei produse de celulele polimorfonucleare (PMN). Rezultatele pozitive ale testului LE apar cu infecții cauzate de un număr de agenți diferiți, inclusiv C. trachomatis și N. gonorrhoeae.

sensibilitatea testului LE pentru detectarea infecției cu C. trachomatis variază foarte mult de la 31 la 100%, iar specificitățile variază de la 83 la 100% 60. Testul LE a fost considerat cel mai bun test de screening pentru bărbații adolescenți și, conform majorității rapoartelor, nu ar trebui utilizat pentru testarea specimenelor de la femei sau bărbați mai în vârstă din cauza performanțelor nesatisfăcătoare.

(iii) teste rapide la punctul de îngrijire (POC)

testele rapide, numite și teste „punct de îngrijire” pentru C. trachomatis folosesc tehnologia EIA în formate bazate în principal pe captarea membranei sau imunodifuzia latexului. Testele rapide sunt efectuate în cabinetele medicului, nu necesită echipamente sofisticate și pot fi finalizate în aproximativ 30 de minute. Rezultatele sunt citite vizual și sunt astfel calitative. Deși mai multe kituri sunt disponibile comercial, dar niciunul nu a fost bine evaluat. În general, testele rapide sunt semnificativ mai puțin sensibile și specifice decât EIA efectuate în laborator. Comparativ cu PCR, sensibilitatea și Specificitatea testului Clearview (Unipath Ltd., Marea Britanie) au fost 53,8 și, respectiv, 99,1 la sută cu specimene de tampon endocervical și 31,1 și 95,2 la sută cu specimene de tampon vaginal de la femei Filipineze61. Testele rapide oferă un avantaj față de testele convenționale de laborator numai atunci când rezultatele sunt necesare imediat pentru gestionarea pacientului. Testele rapide nu trebuie utilizate la o populație cu prevalență scăzută sau la persoanele asimptomatice din cauza potențialului de rezultate fals pozitive. Rezultatele unui test rapid trebuie considerate întotdeauna prezumtive și, dacă sunt pozitive, trebuie confirmate printr-un test efectuat în laborator.

În concluzie, deși cultura este 100% specifică, sensibilitatea sa estimată poate fi de până la 50%. Majoritatea laboratoarelor s-au îndepărtat de cultură din cauza cheltuielilor implicate, a timpului și a dificultăților tehnice. Astfel, în loc de cultură ca standard de aur de diagnostic, standardul de aur extins/standardul de referință definit, adică rezultatul în mod obișnuit consecvent cu două tehnici non-culturale, este considerat util ca instrument de cercetare43.

(iv) Serologie

testele serologice nu sunt în general utile în diagnosticul infecțiilor tractului genital cauzate de C. trachomatis. Anticorpi provocați de C. infecția cu trachomatis este de lungă durată și un test pozitiv de anticorpi nu va distinge o infecție anterioară de o infecție actuală.