Milano și alte cinci orașe au rezistat, iar în octombrie 1238 a trebuit să ridice asediul Bresciei. În același an, căsătoria fiului natural al lui Frederic Enzio cu Prințesa sardiniană Adelasia și desemnarea lui Enzio ca rege al Sardiniei, în care papalitatea pretindea suzeranitate, a dus la ruperea finală cu Papa. Grigore al IX-lea nu avea încredere profundă în Frederic atât în chestiuni religioase, cât și politice: Frederick trebuia să fi glumit că Moise, Hristos și Mahomed erau trei impostori care fuseseră ei înșiși păcăliți, iar în arena politică Papa se temea că Statele Papale erau pe cale să fie izolate și înconjurate, în special pentru că la Roma se formase un partid proimperial. Sub pretextul că împăratul intenționa să-l alunge de la Roma, Grigorie l-a excomunicat pe Frederic pentru a doua oară în Duminica Floriilor, 20 martie 1239. Acesta a fost începutul ultimei faze a luptei gigantice dintre papalitate și imperiu; s-a încheiat cu moartea împăratului și Căderea casei sale.

Frederick a contracarat excomunicarea cu o serie de manifeste importante, majoritatea compuse de Pietro della Vigna, membru al Cancelariei imperiale, care avea daruri literare remarcabile. Manifestul a subliniat că cardinalii trebuiau să participe la conducerea bisericii, iar Frederick chiar a încercat să evoce solidaritatea între prinții seculari. Cu toate acestea, el și-a intensificat activitățile militare în nordul Italiei. Pentru a-și finanța nevoia în continuă creștere de arme, el a instituit o reorganizare administrativă amănunțită a Italiei Imperiale (printre altele, formarea a 10 vice regențe) și a Regatului Siciliei. În plus, el a decretat supravegherea riguroasă a populației. În centrul Italiei a luat ofensiva, ocupând Marșul Ancona si Ducatul de Spoleto, iar în februarie 1240 armata sa a mărșăluit în Statele Papale și a amenințat Roma. În ultimul moment, însă, Papa a câștigat sprijinul romanilor.

după înfrângerea unei flote genoveze care aducea delegați pentru un consiliu papal la Roma, peste 100 de ecleziastici de rang înalt-cardinali și episcopi printre ei—au fost luați prizonieri ai lui Frederic în Apulia. Această victorie militară s-a dovedit, totuși, a fi un dezavantaj politic: a furnizat material pentru propagandă care îl descrie pe Frederic ca un asupritor al Bisericii.în timp ce era încă în tabără înainte de Roma, Frederic a primit vestea morții Papei Grigore și apoi s-a retras în Sicilia. Între timp, mongolii invadaseră Europa. Au fost opriți temporar în bătălia extrem de sângeroasă de la Liegnitz în Silezia la 9 aprilie 1241, dar probabil doar moartea subită a liderului lor, Marele khan a împiedicat avansurile Mongole în acel moment.scurt pontificat al lui Celestine al IV-lea a fost urmat de un interregn lung. Când în 1243 Inocențiu al IV-lea a fost ales, Frederic, la îndemnul prinților germani și al regelui Ludovic al IX-lea al Franței, a deschis negocierile cu noul papă. Acordul dintre papă și împărat părea aproape de evacuarea Statelor Papale, când în iunie 1244 Inocențiu a fugit din oraș. La Lyon a convocat un consiliu pentru 1245 și în iulie a acelui an L-a destituit pe împărat, obstacolul în calea reconcilierii fiind aparent statutul Comunelor Lombarde.

lupta dintre împărat și papalitate s-a dezlănțuit apoi în plină furie. Pe partea papală, împăratul a fost marcat ca precursor al Anticristului; pe partea imperială a fost salutat ca Mesia. Împăratul a susținut cererea contemporană ca Biserica să se întoarcă la sărăcia și sfințenia comunității creștine timpurii și a făcut din nou apel la prinții Europei să se alăture într-o ligă defensivă împotriva prelaților înfometați de putere. Cu toate acestea, majoritatea prinților au rămas neutri și, deși doi antikings germani succesivi au primit puțin sprijin, împăratul a pierdut constant teren în Germania.

în mai 1247 călătoria planificată a lui Frederic la Lyon pentru a-și pleda propriul caz în fața Consiliului papal a fost întreruptă de revolta orașului Parma plasat strategic. În urma acestui dezastru, o mare parte din Italia Centrală și Romagna au fost pierdute. În anul următor, împăratul urma să sufere alte lovituri de soartă; Pietro della Vigna, timp de mulți ani confidentul împăratului, a fost acuzat de trădare și s-a sinucis în închisoare. În mai 1249 Regele Enzio al Sardiniei, fiul favorit al lui Frederic, a fost capturat de bolognezi și a fost ținut încarcerat până la moartea sa în 1272.poziția împăratului, atât în Italia, cât și—prin eforturile fiului său, Conrad al IV—lea-în Germania, s-a îmbunătățit când a murit pe neașteptate în 1250. A fost înmormântat în Catedrala din Palermo lângă prima sa soție, părinții săi și bunicul său Normand.

când vestea morții sale a fost publicată, toată Europa a fost profund zguduită. Au apărut îndoieli că era cu adevărat mort; fals Fredericks a apărut peste tot; în Sicilia a crescut o legendă că fusese transmis vulcanului Aetna; în Germania că a fost încapsulat într-un munte și se va întoarce ca împărat din Zilele din urmă pentru a pedepsi Biserica lumească și a restabili pașnic Sfântul Imperiu Roman. Cu toate acestea, el a fost, de asemenea, gândit să trăiască în moștenitorii săi. De fapt, însă, în termen de 22 de ani de la moartea sa, toți erau morți: victime ale bătăliei cu papalitatea pe care tatăl lor o începuse.