material vegetal

observațiile și analizele chimice au fost efectuate în perioada 2011-2018 pe o colecție de plante cultivate în grădina experimentală din Campusul Universității Louvain-la-Neuve (50 octombrie 39’55″N; 4 octombrie 37’11″E). Înainte și în timpul perioadei de înflorire (iulie–August) plantele au fost plasate în camerele de creștere ale universității în condiții controlate (24/22 CTF C; 16 L:8D, RH 80 CTF 10%).

material pentru insecte

principalele specii vizitatoare de insecte de A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum și B. terrestris) au fost utilizate în încercări de atractivitate a florilor și preferință gustativă. Indivizii A. mellifera și B. pascuorum (10 pe test și tratament) au fost colectați în sălbăticie în jurul campusului universitar (minimum patru locații pe specie) dimineața înainte de teste. Ca B. indivizii terrestris nu se pot distinge cu ușurință în domeniu (morfologie similară pentru mai multe specii), am folosit bondari din patru stupi (Biobest, Westerloo, Belgia) plasați în vecinătatea clădirilor universității pentru a obține indivizi pentru experimentare.

trăsături florale

numărătoarea polenului

anterele a 10 flori la fazele masculine și feminine au fost colectate, numărate, uscate și așezate pe o sită (90 de metri cubi) pentru a fi frecate pentru a colecta boabele de polen. Cantitatea de boabe de polen a fost cântărită. Numărul de polen a fost efectuat la Universitatea Lille-1 (Unitatea Evo-Eco-Paleo). Am folosit un contor de particule pentru a estima numărul de boabe de polen din aceste probe. Cu o zi înainte de numărarea polenului, probele au fost plasate într-un încălzitor cu tub până când cea mai mare parte a etanolului s-a evaporat. Apoi am forțat dehiscența anteră prin plasarea probelor într-un cuptor la 56 C peste noapte. Am adăugat 1 mL de apă distilată la fiecare probă de polen. Tuburile au fost apoi sonicate și vortexate pentru a separa boabele de polen de anterele și reciproc. Soluția de polen (200 Ilfov) a fost apoi diluată în 5 mL tampon izotonic de măsurare (CASY Ilfov ton). Contorul de particule a analizat trei probe de 400-Ilfov din suspensia de polen, furnizând un număr total de particule în acest volum de 1200 Ilfov,precum și un număr de 400 de clase de dimensiuni cuprinse între 0,125 și 150 Ilfov. Comparațiile cu probele goale ne-au permis să identificăm vârfuri de particule, cu dimensiuni cuprinse între 20 și 30 de Centimetre, care corespund boabelor de polen. Numărul de boabe de polen per anteră a fost estimat prin înmulțirea valorilor furnizate de contorul de particule cu raportul de diluare (adică.(1000/200) × (5000 + 200)/1200).

culoarea și morfologia florilor

am măsurat trăsăturile florale (lungimea corolei, diametrul corolei, culoarea florală și reflectanța UV) pe 10 flori pe fază (de la 10 indivizi diferiți). Lățimea căștii, lungimea corolei și diametrul au fost măsurate cu un etrier. Am măsurat spectrul de reflexie a culorii tepal folosind un spectrometru cu fibră optică (Avaspec-ULS2048) și o sursă de lumină pulsată cu xenon (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Olanda). Pentru măsurătorile de reflexie UV, florile au fost fixate pe un fundal negru și fotografiate cu un Nikon D40 (coastă optică 60 mm 1:4 UV-VIS-IR ApoMacro; Filtre X-Nite 330).

colecția florală volatilă

am prelevat compuși organici volatili (COV) din flori intacte de fază masculină și feminină (N = 4 pentru fiecare fază). Fiecare floare a fost introdusă individual într-un bec de sticlă (lungime de 50 mm și diametru de 30 mm), cu o deschidere cu diametrul de 17 mm. Pentru a preveni contaminarea aerului, un tub de teflon umplut cu cărbune activ a fost conectat la un capăt al becului de sticlă și la celălalt capăt au fost conectate două tuburi de sticlă Tenax TA (6 mm 4 mm, 7 inci; 60-80 ochiuri, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgia). Tuburile Tenax au fost conectate la pompe de aer calibrate (Gilair plus, Sensidyn, Sankt Petersburg, SUA) la un debit de 50 mL·min−1 timp de 180 min (între orele 11:00 și 14:00 h). Condițiile de laborator au variat între 21,5 și 23,5 C cu 45 până la 55% Rh.

Cov−urile captate au fost apoi desorbite termic pe un cromatograf de gaz Agilent 6800 echipat cu o unitate de termodesorbție Gerstel TDU și criocooler CIS menținut la -50 CTF C. Imediat după termodesorbție, unitatea CIS t CTF a fost programată de la -50 CTF C la 300 CTF C la 12 CTF sec-1. Aparatul GLC a fost cuplat la un spectrometru de masă Agilent 7975 C. Condițiile analitice au fost următoarele: injecție în modul split (cu un raport de divizare de 50:1, heliu la 1,6 mL min−1 ca gaz purtător), VF-Max MS 30 m x 250 column (DF = 0,25 centimetric) (Agilent). Temperatura program care să permită cea mai bună separare (testele preliminare nu arată) a fost fixat după cum urmează: 40 °C (5 min), apoi la 75 °C la 4 °C min−1, iar la 115 °C (3 °C min−1) și, în sfârșit, la 250 °C la 13 °C min−1. Condițiile SM au fost următoarele: Modul EI la 70 eV, sursa t XCT = 250 XCT, cvadrupolul MS la 200 XCT și intervalul de masă scanat de la 35 la 500 amu.

cromatogramele înregistrate au fost interpretate sistematic pentru a căuta COV-uri specifice fazelor masculine sau feminine. Când au fost detectate, moleculele au fost identificate conform bazelor de date computerizate (Wiley 250.L și PAL 600). Identificările au fost coroborate pe baza datelor de retenție ale moleculelor pure disponibile în comerț. Acestea au fost, de asemenea, cuantificate în raport cu standardul intern foarte pur (limonen, soluție de metanol 1 ilqutl la 0.67-x-x-x-x-x-1 adăugat automat la fiecare tub de desorbție înainte de procesul termic).

aerul ambiant a fost, de asemenea, colectat ca un control pentru identificarea contaminanților de fond. Pentru a preveni o posibilă descoperire, un al doilea cartuș de sticlă încărcat cu același adsorbant (Tenax TA) a fost plasat sistematic în tandem. Analiza nu a evidențiat urme ale moleculelor de interes.

colectarea și analiza alcaloizilor

anterele au fost colectate de la 50 de flori (de la 10 indivizi), uscate și apoi zdrobite pe o sită (90 de metri cubi) pentru colectarea boabelor de polen. Trei replici de 15 mg de polen au fost prelevate pentru alcaloizi. Probele au fost congelate (-80 C) timp de 2 ore și apoi liofilizate. Probele uscate au fost măcinate într-o pulbere fină cu azot lichid, iar cantitățile cântărite de pulbere au fost plasate într-un tub de microcentrifugă de 1,5 mL (Eppendorf, Hamburg, Germania). Alcaloizii au fost extrași cu ajutorul unui omogenizator de țesut (VWR Ultrasonic Cleaner) timp de 10 min în 100 ilqq de tampon de extracție (70% metanol apos și 0,5% acid formic). După centrifugare la 12.000 rpm Timp de 5 min (centrifugă 5430 R), supernatantul a fost transferat într-un tub de microcentrifugă de 1,5 mL. După uscare într-un SpeedVac, alcaloizii au fost resuspendați în 200 unqq de metanol de grad LC-MS și filtrați cu un filtru de seringă PTFE de 0,45 unqq (Whatman).

nectarul a fost colectat în tuburi capilare din sticlă de 5-unqql (Hirschmann Laborger, Eberstadt, Germania) de la 50 de flori (de la 10 persoane). Trei replici de 15 ilqt de nectar au fost uscate într-un SpeedVac și omogenizate în 200 ilqt de metanol de grad LC-MS înainte de filtrare cu un filtru de seringă PTFE de 0,45 ilqtfe (Whatman).

analizele chimice au fost efectuate folosind un sistem LC-MS / MS format dintr-o pompă Thermo Accela, autosampler, detector de matrice de fotodiode și un detector de masă Thermo Scientific LTQ orbitrap XL (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Woluwe, Belgia). S-a utilizat o coloană Phenomenex Gemini C18 (2 mm X. O. 150 mm, ambalată cu particule de 3-X. O. M.). S−a utilizat un sistem binar de solvenți cu un debit de 300 unqql min-1: solvent a, apă de calitate HPLC (0,1% acid formic); și solvent B, metanol de calitate LC-MS (0 min: 95% a, 10-12 min: 0% a, 13-17 min: 95% a). S-a injectat un volum de 10-ILC și temperatura coloanei a fost setată la 30 ILC C. S-a efectuat MS de înaltă rezoluție cu o sursă de ionizare electrospray în mod pozitiv. S-au aplicat următoarele condiții de admisie: temperatura capilară, 275 CTC; tensiunea capilară, 13 V; lentilă tubulară, 140 V; debit de gaz înveliș, 30 u.a.; și debit auxiliar de gaz, 10 u.a. achiziția și prelucrarea datelor au fost efectuate cu software-ul Xcalibur. Această metodă a acoperit gama de masă a tuturor alcaloizilor (MW de la 329 la 673). Alcaloizii din polen și nectar au fost detectați și identificați provizoriu de SM de înaltă rezoluție. Fragmentarea obținută prin disocierea indusă de coliziune a ajutat la identificare. Concentrațiile de alcaloizi au fost calculate pe baza unei curbe standard de aconitină în MeOH și exprimate ca „echivalent aconitină”. Alcaloizii analizați au fost selectați pe baza prezenței lor la alte specii de Aconitum4, 8.

producția de Nectar și compoziția zahărului

nectarul a fost colectat în tuburi capilare de sticlă de 5-unqql (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Germania) din florile plantelor transferate în camerele de creștere din Campusul Universitar (fără vizite la insecte). Am estimat tendința producției de nectar în timpul zilei la începutul antezei prin prelevarea a 2 Flori de la 12 persoane la fiecare 2 ore pe parcursul a 10 ore. De asemenea, am măsurat producția totală de nectar pe floare (2 Flori de la 12 persoane) pentru aceleași flori la fiecare 2 zile pe întreaga durată de viață a florii (9 zile), la aceeași oră în fiecare zi, la 2 ore după ce lumina a fost aprinsă. Producția totală pentru fazele masculine și feminine a fost estimată din eșantionarea la sfârșitul fazelor masculine (5 zile după anteză) și feminine (8 zile).

probele de Nectar au fost depozitate la -80 centicc până la efectuarea analizelor chimice. După derivare, identificarea și cuantificarea zahărului au fost efectuate de GC-MS (Thermo Trace 1310 /Thermo ISQ-QD). S-a utilizat o coloană Restek RXI-5SIL MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 mm DF). Debitul a fost de 1,0 mL min-1 (heliu). Raporturile divizate injectate au fost 1/10 pentru hexoze și 1/100 pentru zaharoză. S−au aplicat următoarele condiții de admisie: temperatura cuptorului, 105 centimetric C timp de 4 min, apoi la 280 centimetric C la 15 Centimetric C min-1 (timp de 20 min) și temperatura injectorului de 250 Centimetric C.Conținutul total de zahăr din nectar per floare (mg) a fost apoi calculat ca volum de nectar (uqql) x concentrația totală de zahăr (mg/uqql).

comportamentul insectelor

în 2011 și 2012, au avut loc investigații în cele patru populații naturale rămase în fens, în sudul Belgiei. Dintre acestea, rezervația naturală „les Abattis”(49 sec 40’50″N; 5 sec 32’59” E) conține cea mai mare și mai densă populație (2970 m2 cu 1330 sec 1030 A. napellus flori m−2). La „Fouches” (49 X. C. 4 ‘ 8 „N; 5 X. C. 43′ 06 ” E), care are a doua populație ca mărime (1788 m2), indivizi din A. napellus au fost foarte împrăștiate în zonă și la densități mult mai mici (176 de flori 177 de flori m−2) „Chantemelle”(49 de flori 39’ 37″N; 5 de flori 39’37” E) ” a avut o populație discontinuă formată din trei patch−uri (161, 423 și 500 m2) cu densități relativ scăzute de plante și flori (179 de flori 125 de flori m-2). „Sainte-Marie”(49 X. C. 40’06″N; 5 X. C. 32’56” E) avea o populație mică și neuniformă (292 m2, 152 X. C. 163 flori m−2) care se întindea aproximativ 150 m de-a lungul unei foste căi ferate.

vizitatorii florilor au fost înregistrați în observații de 10 minute în timpul vârfului de înflorire în trei zile consecutive în 2011 (între 30 August și 3 septembrie) și în patru zile în 2012 (între 21 și 27 August) cu condiții meteorologice uscate și calde. Proporția florilor de fază masculină, în aceste zile și la toate populațiile, a fost mai mare decât florile de fază Feminină (aproximativ 85%). Flori în limita a 1 m2 (sau aproximativ cinci plante) au fost observate în același timp. Au fost efectuate cel puțin zece observații pe populație (maximum 16), răspândite pe întreaga populație și pe perioade diferite din timpul zilei. Pentru fiecare vizitator, s-au înregistrat speciile, numărul de flori jefuite și neasfaltate vizitate pe plantă și plasture, timpul petrecut pe o singură floare, precum și comportamentul lor de hrănire (colectarea polenului sau nectarului, vizita legitimă sau ilegitimă, denumită jefuire (jaf de bază, jaf primar și secundar). Pe parcursul a 530 min de observații de flori în 2011 și 400 min în 2012, am înregistrat 183 de vizitatori de flori. Bondarii (B. pascuorum și B. hortorum) și albinele (Apis mellifera) au fost principalii vizitatori ai florilor; au fost observați doar 3 indivizi B. terrestris.

capacitatea de transport a polenului

treizeci de indivizi pe specie au fost uciși cu acetat de etil și au fost stocați individual. Polenul a fost îndepărtat din diferitele părți ale corpului insectelor cu cuburi mici de gelatină-glicerină53. Boabele de polen concentrate în corbicula au fost îndepărtate și nu au fost incluse în analize. Toate boabele de polen au fost numărate prin microscopie luminoasă.

puritatea colectării polenului

am prelevat încărcături de polen de la bondari care vizitează A. napellus în populațiile naturale. În laborator, încărcăturile de polen au fost acetolizate53. Cel puțin 400 de boabe de polen alese aleatoriu din fiecare dintre cele 25 de încărcături de polen au fost identificate și numărate sub microscopie luminoasă.

răspunsurile gustative ale vizitatorilor insectelor

am urmat protocolul lui Ma și colab.54 pentru detectarea aconitinei. Când au fost prinse, albinele individuale au fost înfometate timp de 3 ore într-un flacon de plastic (7 cm lungime, 2,8 cm diametru interior) la temperatura camerei și în întuneric complet în laborator. Am transferat fiecare albină într-un tub de susținere, un tub de centrifugă de 15 mL cu o gaură de 4 mm găurită la vârf și o bucată de plasă de oțel fixată în interior. După o fază de pre-testare cu o picătură de zaharoză, am prezentat soluția de testare într-un tub capilar de sticlă de 100 de centicli și am stors ușor tubul pentru a menține soluția la vârful tubului. Orice insectă fără extensie proboscis după 5 minute a fost eliminată din test. Fazele de testare au durat 2 minute, iar volumul soluției înainte și după testare a fost înregistrat cu un etrier.testele au fost efectuate pe trei specii de vizitatori (A. mellifera, B. pascuorum și B. terrestris). Zece indivizi per specie de insecte au fost testați cu fiecare soluție. Concentrațiile de zaharoză (430 mg-1) și aconitină (232 g−1) au corespuns celor găsite la specia noastră. Au fost prezentate trei soluții: apă deionizată singură (control), soluție de zaharoză pură și soluție de zaharoză plus aconitină.

pentru toate testele, a fost calculat un indice de descurajare pentru fiecare subiect din alegerea de a bea, volumul soluției consumate și timpul de contact cu soluția, după cum urmează: ID = 1 – (alegere pentru zaharoză/alegere pentru zaharoză + aconitină) IX (volum consumat de zaharoză/volum consumat de zaharoză + aconitină) x (timp de contact cu soluția de zaharoză/timp de contact cu zaharoză + soluție de aconitină) x (timp de contact cu zaharoză + soluție de aconitină).

analize statistice

normalitatea datelor a fost estimată folosind testele Shapiro–Wilk, iar homoscedasticitatea a fost verificată folosind testele Levene. Când au fost îndeplinite cerințele de normalitate și homoscedasticitate, s-au efectuat analize ale varianței (ANOVAs) (efect de fază florală asupra volatilelor florale). În caz contrar, testele neparametrice au fost efectuate folosind testul Wilcoxon pentru compararea a două condiții (efectul fazei florale asupra morfologiei florilor și a parametrilor nectarului) și testul Kruskall-Wallis pentru compararea a mai mult de două condiții (efectul insectelor și soluției asupra volumului consumat și durata contactului cu soluția în experimentele gustative, efectul insectelor asupra comportamentului de vizitare) și testele chi-square au fost efectuate pentru a compara procentele de indivizi în experimentele gustative. Analizele ANOVA și non-parametrice au fost urmate de o comparație multi-pereche atunci când au fost comparate mai mult de două condiții. Toate analizele au fost efectuate în SAS Enterprise Guide 7.1. Datele sunt prezentate ca mijloace de abateri standard de la normele de circulație.