spectre de absorbție

spectrul de absorbție al tiaminei a fost înregistrat în raport cu apa (Figura 1), s-a constatat că tiamina prezintă un vârf maxim de absorbție (max. Datorită valorii maxime a tiaminei cu deplasare foarte albastră, determinarea acesteia în forma de dozare bazată pe măsurarea directă a absorbției sale pentru ultraviolete este susceptibilă la interferențe potențiale din partea excipienților comuni. Prin urmare, derivatizarea tiaminei pentru a atinge specii absorbante cu rază vizibilă a fost, fără îndoială, necesară. Astfel, s-a efectuat derivatizarea tiaminei cu NBD-Cl, iar spectrul de absorbție al produsului a fost înregistrat pe martor de reactiv (Figura 1). S-a constatat că produsul este de culoare brună și prezintă o valoare de 434nm, iar valoarea de 342nm a NBD-Cl. Cantitatea de tiamină-NBD-CL derivată a fost deplasată în roșu, eliminând orice interferență potențială. Prin urmare, lungimea de undă 434 nm a fost fixată ca optimă.

optimizarea condițiilor de reacție

Figura 1: spectrele de absorbție ale tiaminei (3), NBD-Cl (2) și ale complexului dintre ele (1).

condițiile optime pentru metoda dezvoltată au fost stabilite prin variația parametrilor pe rând, menținând în același timp ceilalți parametri constanți și urmărind efectul exercitat asupra absorbanței produsului colorat. În vederea stabilirii condițiilor experimentale, s-a investigat efectul diferiților parametri, cum ar fi pH-ul, timpul, volumul tampon și concentrația NBD-Cl.

efectul pH-ului

efectul pH-ului asupra reacției dintre tiamină și NBD-Cl a fost testat prin variația formei pH de la 7,0 la 12,0. Așa cum se arată în Figura 2, absorbanța produsului este scăzută la pH 7,0, indicând faptul că tiamina nu poate reacționa cu (NBD-Cl) în medii neutre. Acest lucru s-a datorat posibil existenței grupării amino a tiaminei sub formă de sare clorhidrat, care împiedică capacitatea de substituție nucleofilă. Pe măsură ce pH-ul a crescut de la 7 la 12, citirile au crescut dramatic, eliberând gruparea amino a tiaminei și facilitează substituția nucleofilă. Absorbția maximă a fost atinsă la valoarea pH-ului de 10,5. La valori ale pH-ului mai mari de 10,5, a apărut o scădere a absorbției. Acest lucru a fost atribuit probabil creșterii cantității de Ion hidroxid care crește rata reacției înapoi a tiaminei cu NBD-Cl.

efectul timpului de reacție

absorbanța produsului de reacție a fost monitorizată la momente diferite (Figura 3). Păstrând intacte alte condiții, absorbanța produsului de reacție a fost urmată după ce a stat în picioare pentru diferite intervale de timp la 25 centi C. rezultatele arată că tiamina reacționează cu NBD-Cl la 25 centi C, iar absorbanța începe să crească treptat și să atingă un maxim după 25 min. Pentru timpi de reacție mai lungi, s-a observat o ușoară scădere a absorbanței. În consecință, 25min a fost setat ca timp de reacție convenabil pentru determinare.

efectul cantității de tampon

Figura 2: Efectul pH-ului asupra reacției tiaminei cu NBD-Cl.
tiamina (20 de grame/ml): 1 ml, NBD-CL conc. 0,2% (g/ v), timp de reacție 20 min.

Figura 3: efectul timpului de reacție asupra reacției tiaminei cu NBD-Cl.
tiamina (20 de grame/ml): 1 ml, tampon (pH 10.5): 1,5 ml, NBD-CL conc. 0, 2% (g/v).

menținând pH-ul la 10,5, a fost studiat și efectul cantității de soluție tampon asupra absorbanței produsului de reacție (Figura 4). Figura arată că absorbanța produsului de reacție se îmbunătățește rapid odată cu creșterea cantității de soluție tampon și devine maximă atunci când cantitatea de soluție tampon ajunge la 1,5 mL. Prin urmare, a fost selectată cantitatea de soluție tampon de 1,5 mL pentru a asigura cea mai mare absorbție.

efectul concentrației de NBD-Cl

studiul efectului concentrațiilor de NBD-Cl a arătat că reacția a fost dependentă de concentrația reactivului. Cea mai mare intensitate de absorbție a fost atinsă la concentrația de NBD-Cl de 0,2% (g/v), iar concentrația mai mare de NBD-Cl conduce la o scădere a absorbanței (Figura 5).

din experimentele de reglare a parametrilor de mai sus, condițiile optimizate utilizate pentru testare au fost: pH 10,5, concentrație NBD-Cl 0,2% (g / v), volumul tamponului 1,5 mL, timp de reacție 25min și temperatură 25 CTC.

Figura 4: efectul cantității tampon (ml) asupra reacției tiaminei cu NBD-Cl.
tiamina (20 de grame/ml): 1 ml, tampon pH: 10,5, NBD-CL conc. 0,2% (g/ v), timp de reacție 25 min.

Figura 5: efectul concentrației NBD-Cl asupra reacției sale cu tiamina.
tiamina (20 de grame/ml): 1 ml, tampon (pH 10,5): 1,5 ml, timp de reacție 25 min.

Validarea metodei

metoda a fost validată pentru următorii parametri: specificitate, liniaritate, precizie, precizie, limită de detecție (LOD), limită de cuantificare (LOQ) și robustețe în conformitate cu orientările Conferinței Internaționale de armonizare (ICH).

liniaritate, limită de detecție (LOD) limita de cuantificare (LOQ)

liniaritatea a fost evaluată prin analiza de regresie liniară determinată prin construirea a șapte concentrații de tiamină, în intervalul 05–35-XQ / mL, care a fost calculată prin metoda regresiei cel mai puțin pătrate pentru a calcula ecuația de calibrare și coeficientul de corelație. Curbele de calibrare au fost construite prin trasarea concentrației versus absorbanță, utilizând analiza de regresie liniară. Ecuația de regresie pentru rezultate a fost A=0,033 x-0,009 (r2=0,999), unde A este absorbanța la 434 nm, x este concentrația de tiamină în hectog/mL în intervalul 05-35 hectog/mL, iar r este coeficientul de corelație (Tabelul 1). S-a constatat că intervalul de concentrație liniară este comparabil cu metoda noastră anterioară folosind NQS . Limita de detecție (LOD) și limita de cuantificare (LOQ) au fost determinate conform următoarei formule LOD=3.3 SDA/B și LOQ = 10 SDA / b, sda este abaterea standard a interceptării; b este panta conform liniilor directoare ICH . S-a constatat că LOD și LOQ au fost de 0,667 și, respectiv, 2,020 hectolitri/mL (Tabelul 1).

precizie

precizia metodei propuse s-a realizat prin aplicarea a 3 concentrații diferite de 10, 20 și 30 de grame / mL de tiamină în intervalul liniar calculat ca procent din medicamentul recuperat din probe (Tabelul 2).

eroarea relativă (RE) a fost de 0,24%, cu deviația standard corespunzătoare de 0,004 pentru trei determinări diferite (Tabelul 3).

robustețe

mecanism de reacție: s-a raportat că NBD-Cl reacționează cu gruparea amino a derivaților aminici primari sau secundari . În mod similar, grupul amino al tiaminei poate acționa ca un nucleofil datorită perechii singure de electroni de pe atomul de azot, tendința de a ataca centrul cu deficit de electroni din NBD–Cl (Tabelul 4 & Figura 6). În același timp, sa demonstrat că compoziția produsului este 1:1 de tiamină și NBD-Cl (Figura 7). Deci, se concluzionează că gruparea amino a tiaminei reacționează cu NBD-Cl pentru a forma un aduct maro. Ecuația de reacție este prezentată în Figura 7.

Figura 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

aplicarea metodei propuse la analiza formei de dozare a tiaminei

comprimatele de tiamină au fost supuse analizei propuse și afirmația de pe etichetă este de acord cu noua noastră metodă așa cum se arată în tabelul 5. Metoda propusă are avantajul de a fi practic lipsită de interferențe de către excipienți.

Figure 7: Reacția tiaminei cu NBD-Cl care prezintă stoichiometrie 1: 1.