UM GDF11/inibidor da miostatina, GDF11 propeptide-Fc, aumenta a massa muscular esquelética e melhora da força muscular, distróficos mdx ratos
GDF11PRO-Fc liga para tanto GDF11 e MSTN
Para mostrar que GDF11PRO-Fc podem seqüestrar o ativo maduro GDF11 dímero através de uma interação direta, buscou-se identificar uma proteína-proteína de interação entre GDF11 e GDF11PRO-Fc. Além disso, devido à estreita homologia estrutural dos dímeros maduros GDF11 e MSTN, também queríamos determinar se o GDF11PRO-Fc associa-se ao MSTN. Para identificar essas interações proteína-proteína, realizamos um conjunto de ensaios de retirada (Fig. 1). Os ligandos rGDF11, rMSTN e ractivina A foram incubados com frações de lisato de células HEK293 transfectadas com um plasmídeo para GDF11PRO-Fc ou MPRO-Fc a pH 7.4. Devido aos fragmentos Fc conjugados nos propeptídeos modificados, as fracções podem ser puxadas directamente para baixo sobre uma resina de agarose a/G de proteína. Como esperado, GDF11PRO-Fc efetivamente derrubou ambos rGDF11 e rMSTN, indicando que GDF11PRO-Fc era capaz de ligar ambos os ligandos. Além disso, o MPRO-Fc conseguiu derrubar tanto o rGDF11 quanto o rMSTN. Tanto GDF11PRO-Fc como MPRO-Fc não foram capazes de puxar para baixo a superfamília TGF-β ligand rActivin a, o que indica que a ligação ligand é específica (Fig. 1). Não foi observada qualquer ligação do GDF11PRO-Fc, MPRO-Fc, rGDF11, rMSTN ou ractivina a numa resina de agarose de controlo sem a proteína A / G. A partir destes resultados, concluímos que o GDF11PRO-Fc se associa espontaneamente aos dímeros maduros do GDF11 e do MSTN a pH fisiológico.
GDF11PRO-Fc associates with GDF11 and MSTN. As interacções proteína-proteína entre GDF11PRO-Fc ou MPRO-Fc e rGDF11, rMSTN ou ractivina a foram determinadas por um ensaio de tracção. O GDF11PRO-Fc ou MPRO-Fc foi incubado com rGDF11, rMSTN ou ractivina a durante 1 h a 4 ° C. Os complexos proteicos fundidos em Fc foram separados com uma resina de agarose revestida de proteína A / G e os eluatos foram executados com um gel de 12% de páginas SDS em condições de redução e sondados por western blot. O controle de entrada foi de 5% do material de entrada. WB western blot
GDF11PRO-Fc blocos GDF11/MSTN induzida por atrofia de C2C12 myotubes
Além de rGDF11 e rMSTN diferenciados myotubes anteriormente foi mostrado para induzir atrofia murino C2C12 e principal esquelético humano myotubes . Tendo determinado que o GDF11PRO-Fc se liga ao GDF11 e ao MSTN, perguntámos em seguida se o GDF11PRO-Fc poderia impedir a atrofia do myotube induzida pelo GDF11/MSTN em miotubos diferenciados do c2c12. Para isso, empacotamos a codificação de sequência de DNA para GDF11PRO-Fc no capsid AAV6 para gerar o vetor AAV6-GDF11PRO-Fc. Nestes experimentos, o vetor AAV6 foi selecionado por sua capacidade de transduzir eficientemente e seletivamente miotubos diferenciados C2C12, mas não mioblastos . Os mioblastos C2C12 foram cultivados e diferenciados durante 5 dias antes do tratamento com AAV6-GDF11PRO-Fc ou AAV6-EGFP (vector de controlo)num MOI de 105 (Fig. 2a). Como esperado, a expressão GFP foi observável em miotubos c2c12 infectados com AAV6-EGFP a 48-72 h após a infecção, e a quantificação de cópias internalizadas do genoma vetorial Por genoma diplóide a 72 h após a infecção indicou que a transdução vetorial foi adequadamente atingida(Fig. 2b e c).
GDF11PRO-Fc bloqueia a atrofia do miotubo induzida pela MSTN nas células C2C12. um esquema detalhando a cronologia experimental em c2c12 myotubes. AAV6-EGFP ou AAV6-GDF11PRO-Fc foi adicionado para C2C12 myotubes em um MOI de 105 no dia 5 pós-diferenciação e 100 ng/ml rGDF11 ou rMSTN foi adicionado no dia 7. Myotubes foram manchados e analisados no dia 10. a expressão do EGFP B era evidente a 48-72 h em miotubos C2C12 tratados com AAV6-EGFP (MOI 10 ). Barras de escala representam 50 µm. c Número de cópia do genoma do Vector por genoma diplóide em miotubos c2c12 72 h após adição de AAV6-EGFP ou AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10 ). d imagens representativas de imunofluorescência de miotubos C2c12. As membranas do miotubo C2C12 foram visualizadas através da coloração com um anticorpo anti-distrofina (vermelho). Os núcleos estavam manchados com DAPI (azul). Inset mostra uma região ampliada. Barras de escala representam 50 µm (painel principal) e 25 µm (inseto de painel). e a fracção de núcleos incorporados em miotubos (Índice de diferenciação) foi calculada e apresentada como uma percentagem de controlo. f diâmetro médio do miotubo em relação ao controlo e (g) distribuição das medições do diâmetro. Para as medições do diâmetro do miotubo, cada miotubo foi medido em três pontos ao longo do comprimento do miotubo e em média. número h de núcleos incorporados por miotubo. Um mínimo de 50 miotubos foram analisados por condição experimental. o pSMAD2 / 3 relativo ao tSMAD2 / 3 foi avaliado por western blot. Igual carregamento de proteínas foi verificado pela coloração de Ponceau e GAPDH foi usado como um controle de carga. Os dados representam resultados de três experiências separadas. Todas as barras de erro representam a média ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3
Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Setenta e duas horas depois, os miotubos foram fixados e manchados para a análise da imunofluorescência usando um anticorpo que reconhece a distrofina (rod 22/rod 23) para visualizar as membranas periféricas do miotubo e o DAPI para manchar os mionucleos (Fig. 2d). Uma redução no índice de diferenciação, que é definido como a proporção de myonuclei incorporados myotubes, foi observada em myotubes tratados com rGDF11 (− 15%, p = 0.0008) ou rMSTN (− 14%, p = 0.0013) em relação ao controle não tratado. No entanto, este efeito foi atenuado em miotubos c2c12 com expressão de GDF11PRO-Fc tratados com rGDF11 (− 1,9%; p = 0.Em comparação com o controlo tratado com rGDF11) ou rMSTN (- 3, 0%; p = 0, 0040, em comparação com o controlo tratado com rMSTN; Fig. 2e). Além disso, os miotubos C2C12 que foram tratados com AAV6-GDF11PRO-Fc resistiram à atrofia do miotubo induzida pela rgdf11 ou pela rMSTN. Uma diminuição substancial no diâmetro médio do miotubo em relação ao controlo foi detectada em miotubos tratados com rGDF11 (− 39%; 0, 0002) ou rMSTN (− 35%; p = 0, 0003) em comparação com o controlo. Pelo contrário, myotubes expressar GDF11PRO-Fc tratados com rGDF11 (− 1,8%; p = 0.0005, em comparação com rGDF11 tratados de controle) ou rMSTN (− 5.3%; p = 0.O 0075, em comparação com o controlo tratado com rMSTN), não foi em grande parte afectado (Fig. 2f e g). Numa experiência separada, o GDF11PRO-Fc não foi capaz de prevenir a atrofia miotubo induzida pela ractivina a, o que está em consonância com a observação de que o GDF11PRO-Fc não se liga à activina A (ficheiro adicional 1: Figura S3).o tratamento com rGDF11 ou rMSTN foi também associado a uma menor proporção de miotubos maduros com um maior número de mionúcleos, o que sugere uma inibição da diferenciação dos miotubos. Os miotubos com mais de 11 mionucleos representavam apenas 5,2% (p = 0,0215) e 7,2% (p = 0.0328) de miotubos analisados em células tratadas com rGDF11 e rMSTN, respectivamente. Em comparação, myotubes com mais de 11 núcleos compunham 26% dos miotubos analisados no controle myotubes. Em myotubes expressar GDF11PRO-Fc, que foram tratados com rGDF11 ou rMSTN, a proporção de myotubes com mais de 11 myonuclei foi de 22% (p = 0.0104, em comparação com rGDF11 tratados de controle) e 19% (p = 0.0404, em comparação com rMSTN tratados de controle), respectivamente (Fig. 2h). Finalmente, de acordo com o que seria esperado seguinte GDF11/MSTN de sinalização na ActRII, um aumento na fosforilada SMAD2/3 (pSMAD2/3) níveis de proteína na myotubes tratados com AAV6-EGFP e rGDF11 ou rMSTN é observável no western blot 24 h após a adição do ligante (Fig. 2i). Este aumento dos níveis de pSMAD2 / 3 esteve ausente em miotubos tratados com AAV6-GDF11PRO-Fc, sugerindo que a expressão GDF11PRO-Fc antagoniza a activação do SMAD2/3 induzida pelo GDF11/MSTN em miotubos diferenciados. Globalmente, estes resultados indicam que o GDF11PRO-Fc foi capaz de prevenir a atrofia miotubular induzida pelo rGDF11 e pelo rMSTN e a inibição da diferenciação nas células C2C12.
Localizada GDF11PRO-Fc expressão induz hipertrofia muscular esquelética em ratos adultos
antes, temos demonstrado que sistémica AAV vetor mediada entrega do gene de GDF11PRO-Fc neonatal em ratos levou a um aumento significativo na taxa de crescimento do músculo esquelético . Contudo, não foi claro a partir deste estudo se o GDF11PRO-Fc simplesmente melhorou o crescimento do músculo esquelético ou induziu efectivamente hipertrofia do músculo esquelético. Além disso, não foi possível determinar se os efeitos do GDF11PRO-Fc foram mediados pelo local bloqueio de GDF11/MSTN no músculo esquelético, ou se os efeitos observados foram devido sistêmica de modulação de GDF11/MSTN. Para abordar estas questões, avaliámos o impacto da administração intramuscular de aav9-GDF11PRO-Fc em ratos adultos C57BL/6J. Nestes estudos, apenas o lado direito foi injectado e o lado esquerdo contralateral foi utilizado como controlo.
peso corporal aumentou ligeiramente ao longo do Tempo em ratinhos tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 10% às 10 semanas; p = 0, 0418; Fig. 3a). Além disso, o único hindlimb força de preensão normalizado para o peso corporal foi significativamente maior em ambos os membros testados individualmente, com o maior magnitude do efeito observado no tratamento com o lado direito hindlimb (+ 37%; p = 0.0177), apesar de um aumento significativo em normalizado força de preensão em não tratada lado esquerdo hindlimb (+ 18%; p = 0.0426) também foi observada. No entanto, esta diferença não atingiu significado quando ambos os membros traseiros foram testados simultaneamente (+ 15%; p = 0, 2375; Fig. 3b). Dez semanas após a administração do vector, o hindlimb do lado direito foi visivelmente maior em ratinhos tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3c). Em ratinhos tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc, a massa húmida do tecido tibial anterior do lado direito injectado (+ 50%; p = 0, 0046) e gastrocnemius (+ 37%; p = 0, 0023) foi significativamente mais elevada em comparação com os controlos tratados com veículos. Não houve diferença estatisticamente significativa na massa do tecido húmido dos músculos traseiros não tratados do lado esquerdo(Fig. 3d). A análise da área de Myofiber revelou um aumento na média da área transversal de myofiber (+15%; p = 0.0078) no gastrocnemius do lado direito injectado AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3e E f). A análise da distribuição MFD também revelou uma mudança para miofibras maiores no lado direito gastrocnemius de ratos injectados com AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3g), indicando que a expressão localizada GDF11PRO-Fc induziu hipertrofia muscular. Em uma sala de coorte, nós também avaliou o impacto da localizadas entrega do gene de GDF11 por uma injeção intramuscular de AAV9-GDF11 para o lado direito hindlimb, e significativa atrofia muscular foi observado 10 semanas pós-tratamento no injetado hindlimb (arquivo Adicionais 1: Figura S4).
GDF11PRO-Fc induz hipertrofia localizada do músculo esquelético após administração intramuscular do gene. Os ratinhos com 8 semanas de idade, C57BL/6J, foram tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 5) ou veículo (n = 5) por injecção intramuscular unilateral no traseiro do lado direito. O braço esquerdo contralateral não foi tratado. Os ratos foram eutanasiados 10 semanas após o tratamento. um peso corporal médio ao longo do tempo. b força de aperto no traseiro normalizada para o peso corporal às 10 semanas após o tratamento. São mostradas medições de um único membro traseiro e ambos os membros traseiros. c músculo traseiro bruto representativo. O membro traseiro injectado é designado com uma seta preta. d massa húmida do tecido tibial anterior e gastrocnêmio. as imagens de imunofluorescência representativas das secções transversais gastrocnemius do lado direito injectadas manchadas com a WGA conjugada com AlexaFluor-488 para visualizar os miofibers. Barras de escala representam 100 µm. f média da secção de miofiber no gastrocnemius do lado direito injectado. g distribuição MFD de Myofiber no gastrocnemius do lado direito injectado. Um mínimo de 500 miofibers foram medidos por rato. h Western blot identification of GDF11PRO-Fc in tissue lisates from injected right-side gastrocnemius and liver samples of treated mice. O GDF11PRO-Fc não foi detectável em ratinhos tratados com veículos. Igual carregamento de proteínas foi verificado pela coloração de Ponceau e GAPDH foi usado como um controle de carga. Todas as barras de erro representam a média ± SEM. *p < 0,05; **p< 0,01; n. s. Não significativo; em comparação com o controlo tratado pelo veículo. TA tibialis anterior, Gás gastrocnêmio
Western blot indicou que o GDF11PRO-Fc proteína foi expressa no AAV9-GDF11PRO-Fc-injetado clique com o botão direito do lado do gastrocnêmio (58 kDa banda; Fig. 3h). No entanto, o GDF11PRO-Fc não foi detectável no gastrocnemius do lado esquerdo não tratado na mesma quantidade total de proteína carregada, sugerindo que a maioria da expressão do músculo esquelético GDF11PRO-Fc foi localizada no traseiro do lado direito injectado (dados não apresentados). O GDF11PRO-Fc foi também detectável no fígado por Western blot, indicando que ocorreu alguma exposição sistémica(Fig. 3h). Esta observação pode muito provavelmente ser atribuída à fuga vascular do vector AAV9 para a circulação sistémica a partir do local da injecção . A partir destes dados, determinamos que o GDF11PRO-Fc induz hipertrofia do músculo esquelético em ratinhos adultos. Além disso, estes efeitos são, pelo menos parcialmente mediados pelo bloqueio local do GDF11/MSTN no músculo esquelético, provavelmente através da inibição das interacções dos ligandos com ActRII no tecido muscular esquelético.em seguida, avaliámos o impacto da expressão sistémica do GDF11PRO-Fc em ratinhos mdx para determinar se o GDF11PRO-Fc pode também induzir hipertrofia e aumento da força no músculo esquelético distrófico. Para efeitos deste ensaio, a construção GDF11PRO-Fc foi modificada com uma mutação para a tornar impermeável à clivagem endógena da metaloproteinase tipo BMP1/TLD (GDF11PRO-Fc D122A) e aumentar a persistência do factor na circulação sistémica . Para estas experiências, tanto AAV9-GDF11PRO-Fc como AAV9-GDF11PRO-Fc D122A foram avaliadas para determinar se a mutação d122a transgene levaria a um efeito mais pronunciado in vivo. Para atingir a expressão sistémica, os ratos mdx foram tratados com Vectores ou veículos através de injecção na veia da cauda. Após a administração intravenosa, o vector AAV9 transduz o fígado do rato com elevada eficiência. Hepatócitos transdutores podem então expressar o transgeno e secretar o produto proteico na circulação sistémica .
a partir de 3 semanas após a injeção, foi observado um aumento significativo no peso corporal, que persistiu durante a duração do ensaio com AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 7,7% em 12 semanas; p = 0.0094) e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 11% a 12 semanas; p = 0,006) tratamento (Fig. 4a). Note-se que, devido à patologia distrófica, os ratos mdx apresentam tipicamente hipertrofia muscular compensatória, o que pode mascarar parcialmente o aumento da massa muscular induzido pela expressão GDF11PRO-Fc. No que diz respeito aos testes da função muscular, os ratos tratados apresentaram uma maior força de aderência anterior, mesmo depois de normalizarem para o peso corporal. No entanto, a diferença na força normalizada da aderência anterior só atingiu significado estatístico no grupo AAV9-GDF11PRO-Fc D122A. Às 12 semanas pós-tratamento, a média normalizada membros anteriores força de preensão foi aumentado em + 28% (p = 0.0873) e + 36% (p = 0.0248) em camundongos tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, respectivamente (Fig. 4b). O desempenho do Rotarod foi também melhorado pelo tratamento de AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, em média (+93% de aumento no tempo de latência rotarod; p = 0, 0127). O desempenho do Rotarod foi também melhorado no grupo AAV9-GDF11PRO-Fc, mas esta diferença não atingiu significância estatística (+ 44% de aumento no tempo de latência do rotarod; p = 0, 2835; Fig. 4c). Não foi observada diferença no tempo de execução da passadeira em nenhum dos grupos(Fig. 4d).
GDF11PRO-Fc melhora a força de aderência e o desempenho rotarod em ratos distróficos mdx. Os ratos mdx com 6 semanas de idade foram tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7), ou veículo (n = 7) através de injecção na veia da cauda. um peso corporal médio ao longo do tempo. b força de aperto dianteira normalizada para o peso corporal ao longo do tempo. c melhor tempo até à queda de rotarod registado desde o pré-tratamento (linha de base) e 12 semanas após o tratamento. A melhor época de três tentativas foi usada para análise. d ensaio de resistência da treadmill à distância Total desde o pré-tratamento (linha de base) e 12 semanas após o tratamento. Todas as barras de erro representam a média ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; n.s. não significativo; comparado com o veículo tratados de controle
No final de 12 semanas de julgamento, a hipertrofia muscular foi flagrantemente evidente no tratamento de ratos (Fig. 5a). As massas médias dos tecidos úmidos das tíbias anterior, gastrocnêmio e quadriceps foram aumentadas em + 17% (p = 0, 0472), + 20% (p = 0, 0011), e + 14% (p = 0.333), respectivamente, no grupo AAV9-GDF11PRO-Fc. No AAV9-GDF11PRO-Fc D122A grupo, estes valores foram aumentado para + 26% (p = 0.0030), + 31% (p = 0,0003), e + 23% (p = 0.0009) sobre o veículo tratados de controle para a mudança na média tibialis anterior massa, gastrocnêmio de massa, e quadríceps massa, respectivamente. Além disso, a massa do tecido húmido do diafragma aumentou + 19% (p = 0, 0162) e + 26% (p = 0, 0014) nos grupos AAV9-GDF11PRO-Fc e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, respectivamente. Curiosamente, a massa cardíaca não foi significativamente alterada pelo tratamento. A média da área transversal de gastrocnemius myofiber foi mais elevada em ratinhos tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 23%; p = 0, 0226) e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 25%; p = 0, 0170; Fig. 5c e d). Na análise de distribuição MFD, o MFD tendeu a atingir um pico de cerca de 20-30 µm em todos os grupos, o que é provável devido à maior proporção de miofibers de pequena regeneração no músculo distrófico. No entanto, o tratamento com AAV9-GDF11PRO-Fc e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A resultou num aumento da proporção de miofibras com DMFs superior a 64 µm, sugerindo que a expressão dos factores induziu hipertrofia miofiber (Fig. 5e) no músculo esquelético.
GDF11PRO-Fc induz hipertrofia do músculo esquelético em ratinhos distróficos mdx. Os ratos mdx com 6 semanas de idade foram tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7), ou veículo (n = 7) através de injecção na veia da cauda. Os ratos foram eutanasiados 12 semanas após o tratamento. uma musculatura significativa do glímb traseiro. b Peso do tecido molhado dos músculos dos membros, diafragma e coração. c Representative immunofluorescence images of gastrocnemius cross-sections stained with AlexaFluor-488-conjugated WGA to visualize myofibers. Barras de escala representam 100 µm. d média da área de miofiber no gastrocnemius. e distribuição de Miofiber MFD no gastrocnemius. Um mínimo de 500 miofibers foram medidos por rato. f identificação do GDF11PRO-Fc por western blot no lisato de tecido hepático e soro de ratinhos tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc. A mesma carga de proteínas foi verificada pela coloração de Ponceau e GAPDH foi usado como um controle de carga em lisatos de tecidos hepáticos. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. não significativo; comparado com o veículo tratados de controle
Western blot confirmou a expressão da proteína dos transgenes no fígado e no soro. Como esperado, a banda a 58 kDa correspondente a GDF11PRO-Fc ou GDF11PRO-Fc D122A de comprimento total foi detectável em ratinhos tratados. Os níveis séricos do comprimento total propeptide foram ligeiramente maiores nos ratos tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc D122A do que naqueles tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc, sugerindo que o soro de persistência do active propeptide foi aumentada pela D122A mutação (Fig. 5f).globalmente, estes resultados indicam que a expressão sistémica do GDF11PRO-Fc e do GDF11PRO-Fc D122A aumenta a massa muscular esquelética em ratinhos MDX distróficos e que esta hipertrofia muscular esquelética está associada a melhorias na força de aperto e na coordenação motora. No entanto, o tratamento não pareceu afectar a resistência muscular com base no desempenho de execução da esteira. Além disso, o mutante D122A pareceu ser um pouco mais eficaz no aumento da massa muscular e função, presumivelmente devido à melhoria da persistência do soro.
Sistêmica GDF11PRO-Fc gene entrega não reduzir o distróficos patologia em camundongos mdx
Uma série de estudos têm relatado que o bloqueio de TGF-β-ActRII-SMAD2/3 de sinalização, quer pela MSTN inibição ou bloqueio de ActRII, pode ter benefícios terapêuticos em modelos animais de DMD . Para determinar o impacto do tratamento AAV9-GDF11PRO-Fc na patologia distrófica, realizámos uma análise histológica dos músculos dos Membros e do diafragma.sinais característicos da patologia distrófica, incluindo necrose muscular, nucleação central, deposição de colagénio intramuscular e presença de infiltrados inflamatórios foram evidentes em todos os grupos mdx (Fig. 6a). No gastrocnemius, a percentagem de área fibrótica foi reduzida em − 39% (p = 0, 0273) em ratinhos tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc. A fibrose no grupo gastrocnemius também diminuiu ligeiramente no grupo AAV9-GDF11PRO-Fc D122A; no entanto, devido à elevada variabilidade inter− individual na fibrose intramuscular do músculo dos Membros, esta diferença não atingiu significado estatístico (- 28%; p = 0, 1230; Fig. 6b). Também não houve diferença significativa observada na proporção de miofibers centralmente nucleados, sugerindo que a regeneração de miofiber estava ocorrendo ativamente em todos os grupos (Fig. 6c). A CK sérica, um marcador de ruptura muscular, também não foi significativamente alterada pelo tratamento (Fig. 6d). Além disso, a deterioração localizada da integridade da membrana de myofiber, medida pela coloração imunofluorescência de IgG anti-rato, foi evidente em todos os grupos mdx. Inesperadamente, ratos mdx tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc D122A exibiram um ligeiro aumento na área IgG-positiva em média, mas esta diferença não atingiu significância estatística (+ 55%; p = 0, 1729; Fig. 6e E f; ficheiro adicional 1: Figura S5). Sinais óbvios de necrose de miofiber, regeneração, nucleação central e penetração de IgG não foram aparentes no tipo selvagem C57BL / 10J gastrocnemius, indicando que estes marcadores são específicos da patologia distrófica(Fig. 6a-f; ficheiro adicional 1: Figura S5).
GDF11PRO-Fc não atenua a distróficos patologia em camundongos mdx. Os ratos mdx com 6 semanas de idade foram tratados com AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) ou veículo (n = 7) por injecção na veia da cauda. O C57BL/10J (n = 5) também foi incluído como um controle de tipo selvagem. Os ratos foram eutanasiados 12 semanas após o tratamento. a Representative HE and MTC staining from gastrocnemius cross-sections of C57BL / 10J and mdx mice. A nucleação Central é evidente em todos os grupos mdx. Áreas localizadas da necrose de miofiber e regeneração são marcadas com uma flecha negra. A área fibrótica é representada pela região azul na coloração do MTC. As barras de escala representam 50 µm nas secções HE e 100 µm nas secções MTC. B Área fibrótica no gastrocnemius, expressa em percentagem da área total da secção transversal do músculo. c percentagem de miofibers exibindo nucleação central. d medição dos níveis circulantes de CK sérico, um marcador de lesão muscular. as imagens de imunofluorescência representativas da coloração da IgG do rato (vermelha) nas secções transversais dos tecidos gastrocnémios. A coloração positiva da IgG indica permeabilidade da miofiber às proteínas séricas e perda de integridade da membrana. As seções foram co-manchadas com WGA para visualizar miofibers individuais. A área ampliada está marcada com uma caixa branca. Myofibers IgG-positivos característicos são representados com uma seta branca. Barras de escala representam 100 µm. f a área de miofibras IgG-positivas, expressa em percentagem da área total da secção transversal do músculo. g representante HE e MTC coloração de secções transversais de diafragma de ratos C57BL / 10J e MDX. A patologia extensa é aparente em ratos mdx, mas não em ratos C57BL/10J. Barras de escala representam 100 µm. h Área fibrótica do diafragma, expressa em percentagem da área transversal total. *p < 0.05; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; n.s. não significativo; comparado ao veículo tratados mdx controles
No diafragma, H&E coloração revelou extensa necrose e intramuscular deposição de colágeno em ambos os tratados e não tratados mdx grupos (Fig. 6g). Semelhante ao observado no músculo gastrocnemius, o tratamento com AAV9-GDF11PRO-Fc ou AAV9-GDF11PRO-Fc D122A produziu uma ligeira redução global da fibrose intramuscular do diafragma. A percentagem média de área fibrótica no diafragma foi reduzida em 15% (p = 0, 0328) e 17% (p = 0.019) com tratamento AAV9-GDF11PRO-Fc e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, respectivamente(Fig. 6h). Como esperado, estas características patológicas estavam em grande parte ausentes no diafragma de ratos selvagens do tipo C57BL/10J (Fig. 6g e h). A partir destes dados, determinamos que o GDF11PRO-Fc e o GDF11PRO-Fc D122A são capazes de inibir ligeiramente a deposição de colagénio intramuscular nos músculos dos Membros e no diafragma durante um período de 3 meses. No entanto, o tratamento não parece interromper o ciclo em curso de degeneração e regeneração muscular no gastrocnêmio ou diafragma de ratos adultos mdx.
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