A Fase Móvel

O móvel de fase invertida-fase de cromatografia é uma mistura de água ou tampão com um solvente orgânico polar, tais como metanol, acetonitrilo, o isopropanol (IPA), ou tetrahidrofurano (THF). A força de eluição aumenta aproximadamente nesta ordem. Os álcoois são dadores de prótons enquanto o acetonitrilo é um aceitador de prótons. As misturas acetonitrilo/água apresentam uma viscosidade inferior em comparação com as misturas dos outros solventes com água. Isto resulta em uma backpressure inferior. As misturas IPA / água têm a viscosidade mais elevada. Devido à menor contrapressão que resulta da viscosidade mais baixa, os dois modificadores orgânicos de fase móvel mais usados são acetonitrilo e metanol. Além disso, o acetonitrilo tem uma baixa absorção no UV baixo, muito menos do que os outros solventes.

A água é o eluente mais fraco na cromatografia de fase reversa. A adição de metanol ou acetonitrilo reduz a retenção. O logaritmo do factor de retenção diminui aproximadamente em proporção com a concentração do solvente orgânico. Se o analito é uma molécula pequena como é o caso da maioria dos medicamentos, a retenção diminuirá aproximadamente sete vezes quando a concentração de metanol na fase móvel aumenta em cerca de 20%. Em muitas circunstâncias (por exemplo, no desenvolvimento de métodos), assume-se que existe uma relação linear entre o logaritmo do fator de retenção e a fração de volume do modificador orgânico na fase móvel. No entanto, devemos considerar isto apenas como uma boa regra de ouro, que não é nem precisa nem teoricamente justificável.

devido às propriedades de solvação do acetonitrilo em comparação com o metanol, a substituição de um solvente com o outro resulta frequentemente numa alteração na ordem de eluição dos analitos (Figura 2). Portanto, esta técnica é frequentemente usada no desenvolvimento de métodos. A mudança de um modificador para outro cria mudanças de seletividade mais significativas do que a mudança da força do solvente sozinho (isto é, mudando simplesmente a concentração do solvente orgânico). THF também muda drasticamente a seletividade. Na verdade, as maiores mudanças de seletividade são muitas vezes causadas pela substituição de algum metanol ou acetonitrilo por THF. No entanto, por várias razões, tais como o seu odor desagradável, a formação de peróxidos e a transparência UV desfavorável, não é usado com muita frequência.

Figura 2. Influência do modificador de fase móvel na seletividade da separação. Topo, acetonitrilo; fundo, metanol. Coluna: XTerra RP18, 4,6 mm×50 mm, 3,5 µm. Gradiente a 2 ml min−1 durante 15 min de 0 a 80% orgânico a pH 3 com formato de amónio. Analitos: 1, triamtereno; 2, clortalidona; 3, althiazida; 4, furosemida; 5, benzetiazida; 6, probenecide; 7, ácido etacrínico; 8, bumetanida; 9, ácido canrenóico. (Cromatograma fornecido por Diane Diehl e Kim Tran, Waters Corporation.)

a interpretação da selectividade do solvente é complicada pelo facto de o solvente orgânico ser adsorvido pelos ligantes de fase estacionária e poder ser considerado como parte da fase estacionária. Recentemente, vários autores têm medido o excesso de superfície dos modificadores orgânicos para fases estacionárias padrão de tipo C18 e encontraram diferenças significativas na solvação superficial entre acetonitrilo e metanol.foi mencionado no início desta secção que o metanol proporciona uma retenção mais elevada do que o acetonitrilo. Isto é ainda mais pronunciado para compostos ionizados do que para compostos não ionizados. Isto faz sentido do ponto de vista de que o metanol adsorvido na fase estacionária facilita a penetração das moléculas ionizadas na fase estacionária. O mesmo padrão é encontrado quando o metanol é comparado com o THF. Estas são características úteis no desenvolvimento de métodos. Por outro lado, os compostos com grupos funcionais de sulfonamida mostram relativamente mais retenção em THF, quando comparados com um grupo de analitos de referência. No geral, uma influência significativa do solvente orgânico na seletividade de uma separação pode ser observada, mas uma racionalização é difícil, uma vez que o solvente pode ser encontrado tanto na fase estacionária – quanto na fase móvel. Alguns autores também tentaram distinguir as fases móveis de alto conteúdo de água das de baixo teor de água.como mencionado acima, as diferenças de selectividade importantes entre os diferentes solventes são uma ferramenta muito útil no desenvolvimento de separações de fase reversa. Sistemas clássicos de desenvolvimento de métodos têm usado metanol, acetonitrilo e THF como os modificadores orgânicos na fase móvel. As selectividades intermédias podem ser obtidas com misturas de solventes, e um ajuste do espaçamento dos picos pode ser realizado sem dificuldade. Os esquemas modernos de desenvolvimento de métodos usam a temperatura como outra variável facilmente controlável no ajuste da seletividade.

Um aspecto importante da selectividade da fase móvel é o seu pH. o controlo da retenção de compostos ionizáveis com a ajuda de tampões ou aditivos ácidos ou de base para a fase móvel é muito importante. Ao escolher judiciosamente o pH da fase móvel, pode-se facilitar a manipulação da retenção e seletividade. Como mencionado acima, a diferença na retenção entre a forma ionizada e não ionizada de um analito pode ser de 10 a 30 vezes, e o controle de pH é importante.

nos últimos anos, pesquisas têm mostrado que tanto o pH quanto as constantes de ionização do tampão são alteradas, quando solventes orgânicos são adicionados a ele. Isto tem consequências importantes para o controlo da retenção. Normalmente pode-se chegar a uma ionização definida do analito se o pH da fase móvel estiver a ±2 unidades de pH do pKa do analito. Mas se o pH e o analito PKA estão ambos mudando com a adição de solvente orgânico, isso não é fácil de lidar com o uso de regras simples. Portanto, um bom controle de pH e um bom buffer são elementos importantes da reprodutibilidade de uma separação de fase reversa de analitos ionizáveis. O pH é medido em água, onde se está familiarizado com os valores de pKa dos buffers comumente usados, e se prefere ficar perto desses valores de pKa. A capacidade máxima de buffer é encontrada no pKa do buffer. Enquanto o pH muda na presença do solvente orgânico, a capacidade do tampão não. Para o praticante de cromatografia de fase reversa, este é um aspecto importante do controle de retenção. Por outro lado, o investigador de mecanismos de retenção de fase reversa precisa de estar preparado para medir o pH na presença do solvente orgânico para compreender plenamente a sua influência na retenção. Tipicamente, a adição do solvente orgânico resulta em um aumento no pKa de ácidos, e em uma diminuição no pKa para bases. Isto aplica-se tanto aos buffers quanto aos analitos. Isto pode resultar em uma mudança significativa no padrão de ionização esperado de um analito. Aqui está um exemplo que ilustra isto: uma amina com um pKa de 9 é completamente ionizada em um tampão fosfato a pH 7 em água, mas pode ser apenas metade ionizada no mesmo tampão após a adição de 70% de metanol. É evidente que esses efeitos são significativos. Portanto, uma maneira precisa de preparar um buffer e controlar seu pH é vital para um bom controle da retenção de fase reversa de analitos ionizáveis.outras interações iônicas afetam a retenção e a seletividade de uma separação de fase reversa de analitos ionizados também. Uma ferramenta clássica para aumentar a retenção de analitos iônicos é a cromatografia de pares iônicos. Nesta técnica, a fase estacionária é equilibrada com um íon carregado hidrofóbico, como um íon ácido sulfônico de cadeia longa (por exemplo, octilsulfonato) ou uma amina quaternária hidrofóbica (por exemplo, o íon tetrabutilamônio). Um móvel típica de uma fase de concentração é de cerca de 10 mM. A adição de íon-par de reagentes para a fase móvel aumenta a retenção de destino íons, diminui a retenção de íons de mesma carga que o íon-par de reagentes, e deixa a retenção dos analitos neutros, incluindo zwitterions quase inalterado. Assim, é uma excelente ferramenta para ajustar a seletividade de uma separação. A razão para essas mudanças na seletividade é o fato de que o reagente de par iônico é adsorvido na superfície da fase estacionária. A interpretação mais simples do mecanismo de retenção resultante é uma combinação de troca iônica com o mecanismo de fase reversa. À medida que a concentração do reagente de par iônico na fase móvel aumenta, a retenção de analitos carregados opostos aumenta inicialmente, e, em seguida, os níveis fora em concentrações mais elevadas. Para reagentes de pares de iões com comprimento de cadeia diferente, a retenção aumenta mais rapidamente com um comprimento de cadeia mais longo.outro efeito de interação iônica encontrado com analitos catiónicos é o aumento da retenção quando pequenos íons inorgânicos são adicionados à fase móvel. As concentrações requeridas são normalmente cerca de 10 vezes superiores às concentrações utilizadas com reagentes de pares iónicos. Aniões típicos deste tipo são perclorato (ClO4 -), tetrafluoroborato (BF4−), ou hexafluorofosfato (PF6−). Aumentam significativamente a retenção de analitos catiónicos. O efeito é mais pronunciado com acetonitrilo como aditivo de fase móvel do que com metanol. Isto é explicado por uma camada mais espessa de acetonitrilo adsorvida na fase estacionária em comparação com uma camada monomolecular de metanol, e a separação do íon contador nesta camada. Do ponto de vista dos usuários, o comportamento de retenção de analitos catiónicos na presença destes aniões inorgânicos não é diferente do observado com reagentes de pares iônicos verdadeiros, ou seja, com ácidos sulfônicos de cadeia longa.