o Diagnóstico

o diagnóstico Clínico: quadro Clínico dos pacientes que sofrem de infecção por chlamydia poderia ser enganosa, como até 70-80 por cento dos infectados mulheres e 50% dos homens infectados são assintomáticos. Tipicamente, uma fêmea com infecção clamidiosa não complicada irá apresentar-se com corrimento vaginal inodoro e mucóide sem prurido. Disúria sem frequência ou urgência será reclamada se a uretra está envolvida. Além disso, na DIP, pode ocorrer história de dor abdominal grave com febre elevada, dispareunia, ciclos menstruais prolongados e hemorragia intermenstural. No exame, cervicite com uma descarga mucóide amarela, turva, pode ser visto a partir do so. O colo do útero tende a sangrar facilmente quando raspado com espátula ou escova. A urinálise revelará a presença de >5 WBC/HPF (campo de alta potência), o que sugere uretritis13. Infecções clamidiosas não podem ser distinguidas de outras infecções uretrais clinicamente. = = Ligações externas = = , libertação significativa de odor na adição de KOH à secreção vaginal) pode ajudar a diferenciar infecções clamidianas de outras infecções do tracto genital inferior, mas tem uma baixa especificidade.

Chlamydial infecção nos machos manifesta-se como uretrite em 15-55 por cento dos afetados menos ou igual a 35 anos, ocasionalmente epididimite pode ser seen2. A descarga uretral ligeira a moderada clara a branca é observada de manhã antes dos vazios do doente. Na epididimite, pode ocorrer história de dor testicular unilateral com eritema escrotal, sensibilidade ou inchaço sobre a epidídima. O diagnóstico pode ser estabelecido pela presença de descarga mucopurulenta do pênis que na coloração de Gram mostra >5 WBC/HPF e ausência de diplococos gram negativo intracelular. A síndrome de Reiter pode ser uma complicação rara da infecção clamidiosa não tratada. Uma artrite reativa que inclui tríade de uretrite/cervicite em fêmeas, conjuntivite e erupção mucopurulenta indolor nas palmas e solas dos pés é vista na síndrome29 de Reiter. As fêmeas são mais afetadas do que os machos. Há múltiplos envolvimentos conjuntos assimétricos com predileção para as extremidades inferiores.diagnóstico laboratorial: a natureza assintomática da doença e o espectro crescente de infecções causadas por C. trachomatis enfatizam a necessidade de métodos laboratoriais sensíveis e confiáveis.a proficiência na recolha e transporte de amostras é fundamental para a exatidão nos testes de diagnóstico. Tanto a sensibilidade como a especificidade dos testes de diagnóstico para C. trachomatis demonstraram estar diretamente relacionadas com a adequação da amostra. As células hospedeiras que abrigam o organismo devem ser incluídas na coleção de espécimes, uma vez que as chlamydiae são agentes patogénicos intracelulares obrigatórios, especialmente em técnicas que envolvem visualização direta do organismo.a escolha dos locais de amostragem pode influenciar a probabilidade de recuperação do agente patogénico. Observou-se um aumento de 10-20% na recuperação de C. trachomatis do tracto genital se ambas as amostras cervicais e uretrais forem colhidas em comparação com a amostragem cervical apenas 42. O esfregaço Endocervical, o esfregaço vaginal/introital, o esfregaço vulval, o esfregaço uretral e rectal e a urina de primeira captura são as amostras comuns colhidas das doentes do sexo feminino. O esfregaço uretral e rectal e a primeira amostra de urina de captura também podem ser colhidos em doentes do sexo masculino, além de outras amostras específicas, como o líquido prostático.garantia de qualidade da recolha e transporte da amostra: a adequação da amostra pode ser determinada pela visualização das células squamo-colunares durante a microscopia. Um espécime é considerado adequado se contiver uma célula colunar/metaplástica por lâmina. A probabilidade de isolamento é optimizada se o espécime for refrigerado imediatamente após a colheita a 2-8°C. O tempo entre a colheita e o processamento da amostra deve ser idealmente inferior a 48 h, SE tal não for possível, estes podem ser congelados a -70 °C até serem processados16. O soro de bovino fetal (2-5%) ajuda a preservar a viabilidade de chlamydiae em espécime, que deve ser congelado. O fosfato de sacarose 2-molar (2-MSP) ou fosfato de glutamato de sacarose são o meio de transporte mais utilizado. Foram desenvolvidos e aprovados meios de transporte sintéticos para cultura e alguns testes não culturais para uso diagnóstico, ou seja, meio de transporte M4, meio Trans Flex e novo meio sintético/universal M4.

O diagnóstico laboratorial da Clamídia consiste dos seguintes métodos:

(i) testes Específicos

Célula cultura: Isolamento do organismo é o método definitivo para o diagnóstico de infecção por chlamydia. A clamídia é um patógeno intracelular obrigatório e, portanto, requer células embrionárias de ovo de galinha ou células animais para cultura. Estes métodos de cultura são tecnicamente difíceis, intensivos em mão-de-obra, pesados e dispendiosos, e não foram amplamente adoptados como um teste de rotina realizado em laboratórios clínicos gerais. No entanto, foram utilizados três sistemas in vitro para a cultura de chlamydiae viz. inoculação de ratinhos (intra-peritoneal, intracraniana e intravenosa), sac-inoculação de gemas (inoculação de gemas de pintos de 7-8 dias de idade) e linhagens de culturas celulares16. As linhas celulares mais usadas incluem-hela 229 células, McCoy células, BHK21 e bgmk cells24.

A sensibilidade da célula de cultura para o isolamento de chlamydiae é reforçada pelo pré-tratamento de células por polycations, DEAE-dextrans, a centrifugação do inóculo para a célula de camada única e de incorporação de anti-metabólitos, tais como a cicloheximida ou cytochalasin B para a cultura de células medium42. O monolayer celular para a cultura de C. trachomatis é cultivado em frascos de tambor ou concha em tampas de vidro ou em Poços de pratos de cultura de células multi -well. O método do frasco para injectáveis da concha é mais sensível para a amostra clínica do que a cultura de células multiwell devido a menos hipóteses de contaminação cruzada 42. Antes da inoculação, o espécime deve ser sonicado para romper as células hospedeiras e separar as inclusões clamidianas. Para inocular as culturas celulares, o meio de cultura sobrenadante deve ser removido e substituído por amostras suficientes no meio de transporte da cultura para cobrir o monocamador e evitar a secagem.

O meio de crescimento mais frequentemente utilizado são Águias, meio essencial mínimo (EMEM) suplementado por aminoácidos e vitaminas, soro de vitelo fetal (5-10), extra glucose (0, 056 m) e 2-glutamina 42. Após a inoculação, as culturas são incubadas a 37o C por 2-3 dias. As inclusões clamidianas são então observadas por coloração imunofluorescente. Demonstrou-se que a sensibilidade do isolamento varia entre 70-85%, dependendo do Laboratório e do sistema de cultura utilizado. Tradicionalmente, este é o “padrão-ouro” para o diagnóstico de C. trachomatis como é 100 por cento específico 42. Infelizmente, está além das capacidades da maioria dos laboratórios públicos e privados, devido à sua procura técnica, intensidade de mão-de-obra e elevado custo.ensaio fluorescente directo (AFD): O teste DFA adiciona a vantagem considerável da coloração de anticorpos específicos da clamídia ao exame direto da amostra e continua a ser uma das técnicas de diagnóstico mais úteis. Neste teste, é utilizada a identificação rápida de corpos elementares em esfregaços com floresceína isotiocinato conjugada com anticorpos monoclonais (FITC – Mab) contra o MOMP ou LPS específicos de géneros. Os corpos elementares aparecem como partículas em forma de disco (300 nm) distintas, acentuadamente delineadas, e os corpos reticulados aparecem cerca de três vezes maiores do que os corpos elementares com um halo fluorescente.este procedimento não exige condições rigorosas para o transporte de espécimes, uma vez que é preparado e subsequentemente transportado para processamento. Com o uso de MOMP de C. trachomatis, a sensibilidade e especificidade do AFD é de 80-90 por cento e 98-99 por cento, respectivamente, em relação à cultura 43. A alta especificidade do AFD é atribuída à sua dependência da visualização da morfologia distintiva e das características de coloração das inclusões chlamydiais. O AFD é o único teste de diagnóstico disponível que permite a avaliação simultânea da adequação da amostra através da Visualização das células epiteliais presentes no esfregaço. É rápido e simples (Tempo de recuperação de cerca de 30 minutos), mas o exame microscópico e a interpretação dos resultados requer especialização. Este método é, portanto, recomendado para laboratórios de baixo volume. Este teste também pode ser aplicado a locais extragenitais. É relatado ser mais sensível do que a cultura para a detecção de clamídia em espécimes endometriais ou tubais42.ELISA (ensaio de Imuno-morbilidade enzimática): ELISA está disponível para a detecção do antigénio C. trachomatis. Para o efeito, estão disponíveis vários kits ELISA disponíveis no mercado. A maioria destes detectam LPS clamidiais que são mais solúveis do que MOMP. Os testes de imunoensaio enzimático (AIA) têm sido relatados como tendo uma sensibilidade de 62-96% e uma especificidade de 86-99% em comparação com a cultura celular 44. Este ensaio é adequado para laboratórios sem acesso à cultura celular. No entanto, diferentes estudos grandes e pequenos em todo o mundo,incluindo a Índia,relataram uma fraca sensibilidade de ELISA em comparação com o AFD e PCR45, 46, 47.citologia: a citologia é um teste de diagnóstico fácil, simples de utilizar e económico. Não são necessárias precauções para o armazenamento e transporte de espécimes e podem também ser detectadas partículas não viáveis/não infecciosas. A qualidade da amostra clínica pode ser avaliada pela técnica microscópica e os procedimentos técnicos utilizados nestes testes são geralmente mais rápidos e mais simples de realizar do que a cultura. Giemsa, immunoflourescence and iodo staining methods are most commonly used. Outras manchas como a Imunoperoxidase, imunoferritina, podem Grunwald, Giemenez, Macchiavello e laranja acridina também podem ser usadas para detectar a inclusão clamidiosa em células esfoliadas. A presença de inclusões intracitoplasmáticas é patogonómica para infecções oculares clamidianas em recém-nascidos, no entanto, este método não é recomendado para diagnosticar conjuntivite ou infecção genital em adultos devido à falta de sensibilidade. Dos três métodos, a imunofluorescência oferece a maior sensibilidade seguida por Giemsa e depois coloração de iodo 42.métodos moleculares: Os métodos tradicionais de diagnóstico têm várias limitações que incluem baixa sensibilidade, tempo de teste longo e alto custo. Por conseguinte, são concebidos testes baseados no reconhecimento directo das sequências de ADN e ARN. A sonda de ADN comercialmente disponível para a detecção de clamídia é o teste PACE 2 (Probe Assay Chemiluminescence Enhanced)48, capaz de detectar também Neisseria gonorrhoeae, que é uma sonda de ADN não isotópica para a detecção de partes específicas de R-RNA de C. trachomatis nas amostras endocervical e uretral. Outro teste de DNA, PACE 2C, também foi desenvolvido, que simultaneamente detecta tanto C. trachomatis quanto N. gonorrhoeae a partir de uma única amostra; no entanto, uma avaliação adicional do PACE 2C é necessária antes de seu uso em diagnósticos. These tests employed a chemiluminescent DNA probe that hybridizes to a species-specific sequence of chlamydial 16S rRNA. Uma vez formado o híbrido ADN-rRNA, é adsorvido num feixe magnético e a resposta quimioluminescente é detectada quantitativamente com um luminómetro. Uma vez que a divisão activa das chlamydiae contém até 104 cópias de 16S rRNA, o teste PACE 2 deve, teoricamente, ser mais sensível do que os sistemas de detecção de antigénios. A sensibilidade do PACE 2 em relação a um padrão de amplificação do DNA ainda não foi bem avaliada, mas foi relatado ser de 77 a 93 por cento 48 em um estudo.

o desenvolvimento de testes baseados na tecnologia de amplificação do ácido nucleico (Naat) tem sido o avanço mais importante no campo do diagnóstico clamdial desde que as técnicas de cultura celular in vitro substituíram o saco da gema para cultura e isolamento do organismo a partir de amostras clínicas. NAAT é pelo menos 20-30 por cento mais sensível (capaz de detectar tão pouco quanto uma única cópia do gene) e 100 por cento específico 49,50. Ele oferece a oportunidade de usar amostras não invasivas como a urina para rastrear infecções em indivíduos assintomáticos que normalmente não procuram cuidados clínicos. Esta é uma vantagem crítica, uma vez que a maioria das infecções clamidianas em mulheres e uma proporção significativa de infecções em homens são assintomáticas. A mais conhecida das tecnologias de amplificação do DNA é a PCR. PCR pode ser Gênero, espécie, grupo ou estirpe específica, dependendo do projeto do iniciador. Os Genes visados para o diagnóstico de C. trachomatis são o gene MOMP, o plasmídeo endogeneoso, o gene fosfolipase e o gene 16S e 23S rRNA. Uma vez que todas as tecnologias de amplificação de ácido nucleico detectam alvos de ácido nucleico, estes não dependem da Viabilidade ou de um estado intacto do organismo alvo para um resultado positivo. Por conseguinte, o transporte da amostra não é uma questão crítica 49. Apesar de não ter sido bem estudado, a” janela ” para o estado negativo da cultura, PCR positivo após a terapia com doxiciclina parece durar até 3 wk29. Após este tempo, os espécimes de pacientes tornam-se tanto cultura e PCR negativo.o teste PCR para detecção de C. trachomatis desenvolvido pela Roche Diagnostics, Basel Switzerland (Roche-Amplicor) foi o primeiro teste PCR a ser aprovado pela FDA nos Estados Unidos. Desde 1993, a PCR Amplicor tem sido relativamente bem avaliada para espécimes urogenitais e de urina, com uma sensibilidade e especificidade globais de 90 e 99 a 100 por cento, respectivamente 51. A PCR Amplicor é aprovada para amostras de urina cervical, uretral masculina e masculina.

Com a explosão de técnicas de biologia molecular mais recentes ensaios como o m2000 sistema (Abbott), bem como de fio-deslocamento de amplificação (SDA) (BD ProbeTec strand displacement amplification desenvolvido pela Becton Dickinson and Company, Sistemas de Diagnóstico, Franklin Lakes, N. J.) e mediada por transcrição de amplificação (TMA) (APTIMA system pela Gen-Probe Inc., San Diego) tornou-se disponível para C. trachomatis. Embora sejam populares nos países desenvolvidos, os seus elevados custos iniciais e de manutenção impedem o seu uso em ambientes pobres em recursos.a carga de C. os organismos traquomáticos no tracto genital (carga clamidiana) podem ser detectados pela PCR quantitativa em tempo real e podem variar de 10 a mais de um milhão de organismos/ml de secreção do tracto genital52. Isto é provável para influenciar o desempenho de diferentes testes de amplificação de ácido nucleico, que não distinguem rotineiramente entre pessoas com cargas clamidiosas altas e baixas. As diferenças na carga clamidiana têm sido relatadas como estando associadas à presença de sintomas clínicos, à transmissibilidade e persistência da infecção e ao risco de desenvolvimento de sequelas crónicas 53. Assim, há um papel crítico de quantificação no diagnóstico e tratamento de infecções clamidianas.

as NAATs são os testes mais sensíveis para o rastreio e diagnóstico de infecções clamidiosas e gonocócicas dos tract54,55,56 genital. No entanto,as dúvidas quanto ao seu desempenho em áreas com baixa prevalência são relatadas57, 58. Em 2002, o CDC recomendou confirmar todos os NAATs positivos para C. trachomatis quando o valor preditivo positivo do teste é <90 por cento59. No entanto, as verdadeiras especificidades dos métodos NAAT são encontrados para ser >99 por cento54, 55.

O CDC tem também sugeriu algumas possíveis estratégias para confirmation59 que incluem (i) o teste de uma segunda amostra com um outro NAAT ter igual ou maior sensibilidade para o primeiro teste, (ii) realização de um diferente NAAT ter igual ou maior sensibilidade para o primeiro teste de segmentação diferentes seqüência de ácidos nucléicos no original da amostra, (iii) repetir o teste original no original da amostra, e (iv) de trazer o paciente de volta para uma contraprova.no entanto, as limitações descritas são que a maioria dos médicos não recolherá duas amostras para a mesma avaliação, Nem é viável trazer de volta o paciente para coletar outra amostra, e a maioria dos laboratórios não tem instalações / capacidade para realizar duas NAATs diferentes.

O conceito de teste de confirmação não é new57. No entanto, complica o tratamento de uma amostra NAAT positiva e adiciona custos a um teste de rastreio já caro. Além disso, ainda há espaço para melhorar a sensibilidade dos NAATs, talvez por melhor preparação de amostras, automação, ou concentração alvo.o teste leucocitário esterase (LE) é um teste rápido de vareta para utilização em amostras de urina. Este teste foi concebido para detectar infecções do tracto urinário através da detecção da enzima produzida pelas células polimorfonucleares (PMN). Os resultados positivos dos testes LE ocorrem com infecções causadas por vários agentes diferentes, incluindo C. trachomatis e N. gonorrhoeae.

a sensibilidade do teste LE para detecção da infecção por C. trachomatis varia muito de 31 a 100%, e as especificidades variam de 83 a 100 %60. O teste LE foi considerado o melhor teste de rastreio para adolescentes do sexo masculino e, de acordo com a maioria dos relatórios, não deve ser utilizado para testar amostras de mulheres ou homens mais velhos devido a um desempenho insatisfatório.(iii) testes de ponto rápido de cuidado (POC) testes rápidos, também chamados testes de “ponto de cuidado” para C. trachomatis empregam tecnologia EIA em formatos baseados principalmente na captura de membrana ou imunodifusão de látex. Testes rápidos são realizados nos escritórios do médico, não requerem equipamentos sofisticados, e podem ser concluídos em cerca de 30 minutos. Os resultados são lidos visualmente e são, portanto, qualitativos. Embora vários kits estejam disponíveis comercialmente, nenhum foi bem avaliado. Em geral, os testes rápidos são significativamente menos sensíveis e específicos do que as Aias realizadas em laboratório. Em comparação com a PCR, a sensibilidade e especificidade do teste Clearview (Unipath Ltd., Reino Unido) foram 53,8 e 99,1 por cento, respectivamente, com amostras de esfregaço endocervical, e 31,1 e 95,2 por cento com amostras de esfregaço vaginal de Mulheres Filipinas61. Os testes rápidos oferecem uma vantagem sobre os testes laboratoriais convencionais apenas quando os resultados são necessários imediatamente para o tratamento dos doentes. Os testes rápidos não devem ser utilizados numa população com baixa prevalência ou em indivíduos assintomáticos devido ao potencial para resultados falsos-positivos. Os resultados de um teste rápido devem ser sempre considerados presumíveis e, se forem positivos, devem ser confirmados por um teste realizado em laboratório.em conclusão, embora a cultura seja 100% específica, a sua sensibilidade estimada pode ser tão baixa como 50%. A maioria dos laboratórios afastou-se da cultura devido às despesas envolvidas, tempo e dificuldades técnicas. Assim, em vez de cultura como um padrão-ouro de diagnóstico, o padrão-ouro expandido/padrão de referência definido, ou seja, resultado comumente consistente com duas técnicas não-Cultura é considerado útil como ferramenta de pesquisa 43.os testes serológicos geralmente não são úteis no diagnóstico de infecções do tracto genital causadas por C. trachomatis. Anticorpos induzidos por C. a infecção trachomatis é longa e um teste de anticorpos positivo não irá distinguir um anterior de uma infecção atual.