material

as Observações e as análises químicas foram realizadas a partir de 2011 a 2018 em uma coleção de plantas cultivadas no jardim experimental na Universidade de Louvain-la-Neuve campus (50°39’55″N; 4°37’11″E). Antes e durante o seu período de floração (julho–agosto), as plantas foram colocadas nas câmaras de crescimento da Universidade sob condições controladas (24/22 °C; 16 L:8D, RH 80 ± 10%).as principais espécies de visitantes de insectos de A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum e B. terrestris) foram utilizadas em ensaios de atractividade das flores e de preferência gustativa. Os indivíduos de A. mellifera e B. pascuorum (10 por teste e tratamento) foram coletados na natureza em torno do campus da universidade (no mínimo quatro locais por espécie) na manhã anterior aos testes. Como B. os indivíduos de terrestris não podem ser facilmente distinguidos no campo (morfologia semelhante para várias espécies), nós usamos bumblebees de quatro colmeias (Biobest, Westerloo, Bélgica) colocados nas proximidades dos edifícios universitários para obter indivíduos para experimentação.traços florais

contagens de pólen

os éteres de 10 flores nas fases masculina e feminina foram colhidos, contados, secos e colocados numa peneira (90 µm) para serem esfregados para recolher grãos de pólen. A quantidade de grãos de pólen foi pesada. As contagens de pólen foram realizadas na Universidade Lille-1 (unidade Evo-Eco-Paleo). Usamos um contador de partículas para estimar o número de grãos de pólen nestas amostras. No dia anterior à contagem de pólen, as amostras foram colocadas em um aquecedor de tubo até que a maior parte do etanol evaporou. Em seguida, forçámos a outra deiscência, colocando as amostras num forno a 56 °C durante a noite. Adicionámos 1 mL de água destilada a cada amostra de pólen. Os tubos foram então sonicados e ventilados para separar grãos de pólen dos anteras e um do outro. A solução de pólen (200 µL) foi então diluída em 5 mL de tampão de medição isotónica (ton CASY®). O contador de partículas analisou três amostras de 400 µL da suspensão de pólen, fornecendo a contagem total de partículas neste volume de 1200 µL, bem como as contagens para 400 classes de dimensão que variam entre 0,125 e 150 µm. Comparações com amostras em branco nos permitiram identificar picos de partículas, com tamanhos variando de 20 a 30 µm, o que corresponde a grãos de pólen. O número de grãos de pólen por antera foi estimado multiplicando os valores fornecidos pelo contador de partículas pela razão de diluição (i.e. (1000/200) × (5000 + 200)/1200).

cor e morfologia da flor

medimos traços florais (Corolla comprimento, corolla diâmetro, Cor floral e reflectância UV) em 10 flores por fase (a partir de 10 indivíduos diferentes). Largura do capacete, corolla comprimento e diâmetro foram medidos com um Caliper. Medimos o espectro de reflectância de cor tépala utilizando um espectrómetro de fibra óptica (Avaspec-ULS2048) e uma fonte de luz pulsada de xenónio (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Países Baixos). Para as medições da reflectância UV, as flores foram fixadas sobre um fundo preto e fotografadas com uma Nikon D40 (óptica costeira de 60 mm 1:4 UV-VIS-IR ApoMacro; Filtre X-Nite 330).recolhemos compostos orgânicos voláteis (COV) de flores de fase macho e fêmea intactas (N = 4 para cada fase). Cada flor foi inserida individualmente numa ampola de vidro (50 mm de comprimento e 30 mm de diâmetro), com uma abertura de 17 mm de diâmetro. Para evitar a contaminação do ar, um tubo de Teflon cheio de carvão activo foi ligado a uma extremidade da ampola de vidro e dois tubos ta de Tenax de vidro (6 mm × 4 mm, 7 polegadas; 60-80 mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Bélgica) foram ligados à outra extremidade. Os tubos Tenax foram ligados a bombas de ar calibradas (Gilair plus, Sensidyn, São Petersburgo, EUA) a um caudal de 50 mL·min−1 durante 180 min (entre 11:00 e 14:00 h). As condições laboratoriais variaram entre 21,5 e 23,5 ° C, com 45 a 55% de HR.

Preso Cov, em seguida, foram termicamente dessorvida no Agilent 6800 cromatógrafo a gás equipado com um Gerstel TDU thermodesorption unidade e CIS cryocooler mantida a -50 °C. Imediatamente após thermodesorption, o CIS unidade T° foi programado de -50 °C a 300 °C a 12 °C s−1. O aparelho GLC foi acoplado a um espectrômetro de massa 7975 C. As condições analíticas foram as seguintes:injecção em modo fraccionado (com uma razão de separação de 50: 1, hélio a 1,6 mL min−1 como gás portador), coluna VF-Max MS 30 m x 250 µm (df = 0,25 µm) (Agilente). A temperatura programa, permitindo que a melhor separação (testes preliminares não mostrado) foi fixada como segue: 40 °C (5 min) em seguida, a 75 °C a 4 °C min−1 e a 115 °C (3 °C min−1) e, finalmente, a 250 °C a 13 °C min−1. As condições em São as seguintes:: Modo EI a 70 eV, fonte T ° = 250 ° C, MS quadrupole a 200 °C e intervalo de massa escaneada de 35 a 500 amu.os cromatogramas registados foram sistematicamente interpretados para procurar Cov específicos das fases masculina ou feminina. Quando detectadas, as moléculas foram identificadas de acordo com bases de dados computadas (Wiley 250.L e PAL 600). As identificações foram corroboradas com base nos dados de retenção de moléculas puras disponíveis comercialmente. Foram também quantificados relativamente ao padrão interno altamente puro (limoneno, solução de 1 µL de metanol a 0.67 µg µL1 adicionado automaticamente a cada tubo de dessorção antes do processo térmico).o ar ambiente também foi coletado como um controle para identificar contaminantes de fundo. Para evitar uma possível sobressaturação, foi sistematicamente colocado em simultâneo um segundo cartucho de vidro carregado com o mesmo adsorvente (Tenax TA). A análise não revelou quaisquer vestígios das moléculas de interesse.recolha e análise de alcalóides

os éteres foram recolhidos de 50 flores (de 10 indivíduos), secos e depois esmagados numa peneira (90 µm) para recolher grãos de pólen. Foram colhidas três replicados de 15 mg de pólen para alcalóides. As amostras foram congeladas (-80 ° C) durante 2 horas e depois liofilizadas. As amostras secas foram trituradas para um pó fino com nitrogênio líquido, e quantidades pesadas de pó foram colocadas em um tubo microcentrifugador de 1,5 mL (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). Os alcalóides foram extraídos utilizando um homogeneizador de tecidos (“VWR Ultrasonic Cleaner”) durante 10 minutos em 100 µL de tampão de extracção (70% de metanol aquoso e 0,5% de ácido fórmico). Após centrifugação a 12 000 rpm durante 5 minutos (Centrifugadora 5430 R), o sobrenadante foi transferido para um tubo de microcentrifugação de 1, 5 mL. Após secagem num Vac rápido, os alcalóides foram ressuspendidos em 200 µL de metanol de grau LC-MS e filtrados com um filtro de seringa de PTFE de 0, 45 µm (Whatman).o néctar foi recolhido em tubos capilares de vidro de 5 µL (Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Alemanha) a partir de 50 flores (de 10 indivíduos). Foram secas três replicados de 15 µL de néctar num Vac rápido e ressuspendidas em 200 µL de metanol de grau LC-MS antes da filtração com um filtro de seringa de PTFE de 0,45 µm (Whatman).

análises químicas foram realizadas usando um sistema LC-MS / MS consistindo de uma bomba termo-Acela, autosampler, detector de matriz de fotodíodo, e um detector de massa LTQ orbitrap XL termo-científico (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Woluwe, Bélgica). Foi utilizada uma coluna Fenomenex Gemini C18 (2 mm × 150 mm, cheia de partículas de 3 µm). Foi utilizado um sistema binário de solventes com um caudal de 300 µL min−1: solvente a, água de qualidade HPLC( ácido fórmico a 0,1%); e solvente B, metanol de grau LC-MS (0 min: 95% a, 10-12 min: 0% a, 13-17 min: 95% a). Injectou-se um volume de 10 µL e a temperatura da coluna foi fixada em 30 °C. A Em De alta resolução foi realizada com uma fonte de ionização por electrospray em modo positivo. As seguintes condições de entrada foram aplicadas: temperatura capilar, 275 °C; Tensão capilar, 13 V; lente de tubo, 140 V; fluxo de gás de bainha, 30 U. A.; e fluxo auxiliar de gás, 10 U. A. aquisição e processamento de dados foram realizados com software Xcalibur. Este método abrangeu a gama de massas de todos os alcalóides (MW de 329 a 673). Os alcalóides do pólen e do néctar foram detectados e tentativamente identificados pela EM de alta resolução. A fragmentação obtida pela dissociação induzida por colisão ajudou na identificação. As concentrações de alcalóides foram calculadas com base numa curva padrão de aconitina em MeOH e expressas como “equivalente-aconitina”. Os alcalóides analisados foram seleccionados com base na sua presença noutras especialidades Aconitum4,8.a produção de néctar e a composição de açúcar foram recolhidas em tubos capilares de vidro de 5 µL (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Alemanha) a partir de flores das plantas transferidas nas câmaras de crescimento do campus universitário (sem visitas de insectos). Estimamos a tendência de produção de néctar durante o dia no início da antese por amostragem de 2 flores de 12 indivíduos a cada 2 horas durante 10 horas. Também medimos a produção total de néctar por flor (2 flores de 12 indivíduos) para as mesmas flores a cada 2 dias durante todo o período de vida da flor (9 dias), à mesma hora todos os dias, 2 horas após a luz ter sido acesa. A produção Total para as fases masculina e feminina foi estimada a partir da amostragem no final das fases Masculina (5 dias após a antese) e feminina (8 dias).as amostras de néctar foram armazenadas a -80 °C até serem realizadas análises químicas. Após a derivação, a identificação e quantificação do açúcar foram realizadas por GC-MS (traço termo 1310 /termo ISQ-QD). Foi utilizada uma coluna Restek Rxi-5Sil MS (30 m x 0,25 mm de ID, 0,25 µm df). O caudal foi de 1, 0 mL min – 1 (hélio). As proporções de divisão injectadas foram de 1/10 para as hexoses e 1/100 para a sacarose. Foram aplicadas as seguintes condições de admissão: temperatura do forno, 105 ° C durante 4 minutos, depois 280 ° C a 15 ° C min−1 (durante 20 minutos) e temperatura do injector a 250 ° C.O teor total de açúcar de néctar por flor (mg) foi então calculado em volume de néctar (µL) x concentração total de açúcar (mg/µL).

comportamento dos Insectos

em 2011 e 2012, foram realizadas investigações nas quatro restantes populações naturais de fens no sul da Bélgica. Destes, a reserva natural “Les Abattis” (49°40’50″N; 5°32’59″E) contém a maior e mais densa população (2970 m2 com 1330 ± 1030 A. napellus flores m−2). Em “Fouches” (49°4 ‘ 8 “n; 5 ° 43′ 06 ” e), que tem a segunda maior população (1788 m2), indivíduos de A. napellus estavam muito espalhados sobre a área e, em muito menor densidades (176 ± 177 flores m−2) “Chantemelle’ (49°39’37″N; 5°39’37″E)” tinha um descontínuo população constituída por três manchas (161, 423, e 500 m2) com níveis relativamente baixos de planta e flor densidades (179 ± 125 flores m−2). “Sainte-Marie”(49°40’06″N; 5°32’56” e) tinha uma população minúscula e irregular (292 m2, 152 ± 163 Flores m−2) que se estendia cerca de 150 m ao longo de uma antiga via férrea.os visitantes da flor foram registrados em observações de 10 minutos durante o pico de floração em três dias consecutivos em 2011 (entre 30 de agosto e 3 de setembro) e em quatro dias em 2012 (entre 21 e 27 de Agosto) com condições climáticas secas e quentes. A proporção de flores da fase masculina, durante estes dias e em todas as populações, foi maior do que as flores da fase feminina (cerca de 85%). As flores dentro de 1 m2 (ou cerca de cinco plantas) foram observadas ao mesmo tempo. Um mínimo de dez observações por população foram realizadas (máximo 16), espalhadas por toda a população e em diferentes momentos durante o dia. Para cada visitante, registramos a espécie, o número de flores roubadas e não dobradas visitadas por planta e emblema, o tempo gasto por flor única, bem como o seu comportamento de busca (pólen ou coleta de néctar, visita legítima ou ilegítima, referida como roubo (roubo de base, roubo primário e secundário). Durante 530 minutos de observações de flores em 2011 e 400 minutos em 2012, registramos 183 visitantes de flores. Bumblebees (B. pascuorum e B. hortorum) e honeybees (Apis mellifera) foram os principais visitantes de flores; apenas 3 indivíduos de terrestris foram observados.30 indivíduos por espécie foram mortos com acetato de etilo, e individualmente armazenados. O pólen foi removido das diferentes partes do corpo de insetos com pequenos cubos de gelatina-glicerina53. Grãos de pólen concentrados na córbica foram removidos e não incluídos em análises. Todos os grãos de pólen foram contados por microscopia leve.recolhemos amostras de cargas de pólen de abelhas que visitavam A. napellus nas populações naturais. No laboratório, as cargas de pólen eram acetolisadas53. Pelo menos 400 grãos de pólen escolhidos aleatoriamente de cada uma das 25 cargas de pólen foram identificados e contados sob microscopia de luz.

Respostas gustativas de visitantes de insectos

seguimos o protocolo de Ma et al.54 para detecção de aconitina. Quando capturadas, as abelhas individuais ficaram famintas durante 3 horas num frasco de plástico (7 cm de comprimento, 2,8 cm de diâmetro interno) à temperatura ambiente e em completa escuridão no laboratório. Transferimos cada abelha para um tubo de retenção, um tubo de centrifugação de 15 mL com um furo de 4 mm perfurado na ponta e um pedaço de malha de aço fixado no interior. Após uma fase de pré-ensaio com uma gota de sacarose, apresentámos a solução de ensaio num tubo capilar de vidro de 100 µL e apertámos suavemente o tubo para manter a solução na extremidade do tubo. Qualquer inseto sem extensão probóscide após 5 minutos foi removido do teste. As fases de ensaio foram de 2 minutos e o volume da solução antes e depois do ensaio foi registado com um calmante.os testes foram realizados com três espécies de visitantes (A. mellifera, B. pascuorum e B. terrestris). Dez indivíduos por espécie de inseto foram testados com cada solução. As concentrações de sacarose (430 µg mg−1) e de aconitina (232 µg g−1) correspondiam às encontradas na nossa espécie. Foram apresentadas três soluções: apenas água desionizada (controlo), solução de sacarose pura e Solução de sacarose e aconitina.para todos os ensaios, foi calculado Um índice de dissuasão para cada indivíduo da escolha da bebida, do volume de solução consumido e do tempo de contacto com a solução, como se segue:: ID = 1- (escolha de sacarose/escolha de sacarose + aconitina) × (volume consumido de sacarose/volume consumido de sacarose + aconitina) × (tempo de contacto com a solução de sacarose/tempo de contato com a sacarose + aconitina solução).

análises estatísticas

a normalidade dos dados foi estimada utilizando testes Shapiro–Wilk, e a homoscedasticidade foi verificada usando os testes de Levene. Quando os requisitos de normalidade e homoscedasticidade foram cumpridos, foram realizadas análises de variância (ANOVAs) (efeito de fase floral sobre as volatilidades florais). Caso contrário, os testes não-paramétricos foram realizadas utilizando-se o teste de Wilcoxon para comparação de duas condições (floral fase efeito sobre a morfologia da flor e do néctar de parâmetros) e Kruskall-Wallis, teste para comparação de mais de duas condições (insetos e solução efeito sobre o volume consumido e o contato de duração, com a solução em gustativos experiências, insetos efeito sobre a visitação de comportamento) e o qui-quadrado testes foram realizados para comparar as percentagens de indivíduos em gustativos experimentos. As análises ANOVA e não paramétricas foram seguidas por comparação multi-emparelhada quando mais de duas condições foram comparadas. Todas as análises foram realizadas no Guia Empresarial SAS 7.1. Os dados são apresentados como médias ± desvios-padrão.