Único feixe de digitalização espectrofotômetro

Existem duas grandes classes de dispositivos: de feixe simples e de duplo feixe. Um espectrofotómetro de feixe duplo compara a intensidade da luz entre dois caminhos luminosos, um com uma amostra de referência e o outro com a amostra de ensaio. Um espectrofotómetro de Feixe único mede a intensidade de luz relativa do feixe antes e depois de uma amostra de ensaio ser inserida. Embora as medições de comparação de instrumentos de feixe duplo são mais fáceis e mais estáveis, os instrumentos de Feixe único podem ter uma gama dinâmica maior e são opticamente mais simples e mais compactos. Além disso, alguns instrumentos especializados, como espectrofotômetros construídos em microscópios ou telescópios, são instrumentos de Feixe único devido à praticidade.historicamente, os espectrofotómetros usam um monocromador contendo uma grelha de difração para produzir o espectro analítico. A grade pode ser móvel ou fixa. Se um único detector, como um tubo fotomultiplicador ou fotodíodo é usado, a grelha pode ser digitalizada passo a passo (espectrofotômetro de varredura) para que o detector possa medir a intensidade da luz em cada comprimento de onda (que corresponderá a cada “passo”). Também podem ser utilizadas matrizes de detectores (espectrofotômetro de matriz), tais como dispositivos acoplados de carga (CCD) ou matrizes de fotodíodo (PDA). Em tais sistemas, a grade é fixa e a intensidade de cada comprimento de onda de luz é medida por um detector diferente na matriz. Adicionalmente, a maioria dos espectrofotômetros médios infravermelhos modernos usam uma técnica de transformada de Fourier para adquirir a informação espectral. Esta técnica é chamada de espectroscopia infravermelha transformada de Fourier.

Ao fazer medições de transmissão, o espectrofotômetro quantitativamente compara a fração de luz que passa através de uma solução de referência e uma solução de teste, eletronicamente, em seguida, compara as intensidades dos dois sinais e calcula a porcentagem de transmissão da amostra comparada ao padrão de referência. Para as medições da refletância, o espectrofotómetro compara quantitativamente a fração de luz que reflete a partir das amostras de referência e de ensaio. A luz da lâmpada-fonte é passada através de um monocromador, que difrata a luz em um “arco-íris” de comprimentos de onda através de um prisma rotativo e produz larguras de banda estreitas deste espectro difratado através de uma fenda mecânica no lado de saída do monocromador. Estas larguras de banda são transmitidas através da amostra de teste. Em seguida, a densidade do fluxo de fótons (watts por metro ao quadrado, geralmente) da luz transmitida ou refletida é medida com um fotodíodo, dispositivo de carga acoplado ou outro sensor de luz. O valor de transmitância ou reflectância para cada comprimento de onda da amostra de ensaio é então comparado com os valores de transmissão ou reflectância da amostra de referência. A maioria dos instrumentos aplicará uma função logarítmica à razão de transmitância linear para calcular a “absorvência” da amostra, um valor proporcional à “concentração” da substância química medida.

em resumo, a sequência de eventos em um espectrofotômetro de varredura é a seguinte:

1. A fonte de luz é shone em um monocromador, difratado em um arco-íris, e dividido em duas vigas. É então escaneado através da amostra e das soluções de referência.as fracções dos comprimentos de onda incidentes são transmitidas ou reflectidas a partir da amostra e da referência.a luz resultante atinge o dispositivo fotodetector, que compara a intensidade relativa dos dois feixes.os circuitos electrónicos convertem as correntes relativas em percentagens de transmissão linear e/ou valores de absorvância/concentração.

num espectrofotómetro de matriz, a sequência é a seguinte::

1. A fonte de luz é brilhava na amostra e focada em uma fenda
2. A transmissão da luz é refratada em um arco-íris com a reflexão ralar
3. A luz resultante atinge o photodetector dispositivo que compara a intensidade do feixe
4. circuitos Eletrônicos converter a relativa correntes para a transmissão linear percentagens e/ou absorvância/concentração de valores

Muitos idosos espectrofotômetros deve ser calibrada através de um procedimento conhecido como o “zeroing”, para equilibrar o nulo saída de corrente dos dois feixes no detector. A transmissão de uma substância de referência é definida como um valor de referência (datum), pelo que a transmissão de todas as outras substâncias é registada em relação à substância inicial “colocada a zero”. O espectrofotómetro converte então a razão de transmissão em “absorvência”, a concentração de componentes específicos da amostra de ensaio em relação à substância inicial.a espectrofotometria é uma técnica importante usada em muitos experimentos bioquímicos que envolvem DNA, RNA e Isolamento proteico, cinética enzimática e análises bioquímicas. Uma vez que as amostras nestas aplicações não estão prontamente disponíveis Em grandes quantidades, elas são especialmente adequadas para serem analisadas nesta técnica não destrutiva. Além disso, uma amostra preciosa pode ser salva utilizando uma plataforma de micro-volume onde é necessária uma quantidade mínima de amostra para análises completas. Uma breve explicação do procedimento de espectrofotometria inclui a comparação da absorvência de uma amostra em branco que não contém um composto colorido a uma amostra que contém um composto colorido. Esta coloração pode ser conseguida quer por um corante como corante azul brilhante Coomasie g-250, medido a 595 nm, quer por uma reacção enzimática, conforme observado entre a β-galactosidase e a ONPG (turns sample yellow), medida a 420 nm.:21-119 O espectrofotômetro é usado para medir coloridos compostos na região do visível de luz (entre 350 nm e 800 nm): 65 assim, ele pode ser usado para encontrar mais informações sobre a substância que está sendo estudada. Em experimentos bioquímicos, uma propriedade química e/ou física é escolhida e o procedimento utilizado é específico a essa propriedade, a fim de obter mais informações sobre a amostra, tais como a quantidade, pureza, atividade enzimática, etc. A espectrofotometria pode ser utilizada para várias técnicas, tais como a determinação da absorvância óptima do comprimento de onda das amostras, a determinação do pH óptimo para a absorção das amostras, a determinação das concentrações de amostras desconhecidas e a determinação do pKa de várias amostras.:A espectrofotometria de 21-119 também é um processo útil para a purificação de proteínas e também pode ser usado como um método para criar testes ópticos de um composto. Espectrofotométrica de dados também pode ser usado em conjunto com a Beer-Lambert Equação, A = − log 10 ⁡ T = ϵ c l = S D {\textstyle A=-\log _{10}T=\epsilon cl=OD}

a fim de determinar vários relacionamentos entre transmitância e concentração e absorbância e concentração.:21-119 Porque um espectrofotômetro mede o comprimento de onda de um composto através de sua cor, de um corante ligação substância pode ser adicionado de forma que ele pode sofrer uma mudança de cor e de ser medido. É possível conhecer as concentrações de uma mistura de dois componentes usando os espectros de absorção das soluções padrão de cada componente. Para isso, é necessário conhecer o coeficiente de extinção desta mistura a dois comprimentos de onda e os coeficientes de extinção das soluções que contêm os pesos conhecidos dos dois componentes. Os espectrofotómetros foram desenvolvidos e melhorados ao longo de décadas e têm sido amplamente utilizados entre os químicos. Além disso, os Espectrofotómetros são especializados para medir os valores de absorção de comprimento de onda da luz UV ou visível.:21-119 é considerado um instrumento altamente precisos que também é muito sensível e, portanto, extremamente preciso, especialmente na determinação de alteração de cor. Este método também é conveniente para uso em experimentos laboratoriais porque é um processo barato e relativamente simples.