os espectros de Absorção

O espectro de absorção de tiamina foi registrado contra a água (Figura 1), verificou-se que a tiamina apresenta um máximo de absorção de pico (λ max) em 235nm. Devido ao elevado desvio de λ max da tiamina, a sua determinação na forma de dosagem baseada na medição directa da sua absorção para o ultravioleta é susceptível a potenciais interferências dos excipientes comuns. Portanto, a derivatização da tiamina para atingir espécies absorventes de gama visível foi sem dúvida necessária. Assim, foi realizada a derivação da tiamina com NBD-Cl e o espectro de absorção do Produto foi registado em relação ao ensaio em branco do reagente (Figura 1). Descobriu-se que o produto é de cor castanha exibindo λmax em 434nm, e o λmax de NBD-Cl era 342nm. O λmax da derivada da tiamina-NBD-Cl foi Red-deslocado, eliminando qualquer interferência potencial. Por conseguinte, o comprimento de onda 434 nm foi fixado como óptimo.

Otimização das condições de reação

Figura 1: espectros de Absorção de Tiamina (3), NBD-Cl (2) e o complexo, entre eles (1).

as condições ideais para o método desenvolvido foram estabelecidas variando os parâmetros um de cada vez, mantendo os outros parâmetros constantes e seguindo o efeito exercido sobre a absorvância do produto colorido. A fim de estabelecer condições experimentais, investigou-se o efeito de vários parâmetros, tais como pH, tempo, volume de tampão e concentração de NBD-Cl.

efeito do pH

o efeito do pH na reacção entre tiamina e NBD-Cl foi testado variando a forma do pH 7.0 a 12.0. Como indicado na Figura 2, a absorvância do produto é baixa a pH 7.0, indicando que a tiamina não pode reagir com (NBD-Cl) em meios neutros. Isto foi possivelmente devido à existência do grupo amino da Tiamina na forma de sal de cloridrato, o que dificulta a capacidade de substituição nucleofílica. Como o pH aumentou de 7 para 12, as leituras aumentaram dramaticamente, liberando o grupo amino da tiamina e facilita a substituição nucleofílica. A absorção máxima foi atingida no valor de pH de 10, 5. Com valores de pH superiores a 10, 5, ocorreu uma diminuição na absorção. Isto foi provavelmente atribuído ao aumento da quantidade de íon hidróxido que aumenta a taxa da reação reversa da tiamina com NBD-Cl. efeito do tempo de reacção a absorvância do produto de reacção foi monitorizada em momentos diferentes (Figura 3). Mantendo intactas outras condições, seguiu-se a absorvância do produto de reacção depois de ter permanecido durante períodos de tempo diferentes a 25°C. os resultados mostram que a tiamina reage com NBD-Cl a 25°C e que a absorvância começa a aumentar gradualmente e a atingir um máximo após 25min. Nos tempos de reacção mais longos, observou-se uma ligeira diminuição da absorvância. Consequentemente, o 25min foi definido como o tempo de reacção conveniente para a determinação.

Efeito da quantidade de buffer

Figura 2: Efeito do pH na reação de Tiamina com NBD-Cl.tiamina (20 µg / ml): 1 ml, NBD-Cl conc. 0, 2% (M/v), Tempo de reacção de 20 minutos.

Figura 3: Efeito do tempo de reação sobre a reação de Tiamina com NBD-Cl. tiamina (20 µg / ml): 1 ml, tampão (pH 10.5): 1, 5 ml, NBD-Cl conc. 0, 2% (m/v).foi também estudado o efeito da quantidade de solução-tampão na absorvância do produto da reacção (Figura 4). A figura revela que a absorvância do produto de reacção aumenta rapidamente com o aumento da quantidade de solução-tampão e torna-se máxima quando a quantidade de solução-tampão atinge 1,5 mL. Por conseguinte, seleccionou-se a quantidade de 1, 5 mL de solução-tampão para assegurar a absorvância mais elevada.

efeito da concentração de NBD-Cl

O estudo do efeito das concentrações de NBD-Cl mostrou que a reacção dependia da concentração de reagente. A intensidade de absorção mais elevada foi atingida à concentração de NBD-Cl de 0,2% (M/v) e uma concentração mais elevada de NBD-Cl conduz a uma diminuição da absorvância (Figura 5).das experiências de ajuste de parâmetros acima referidas, as condições optimizadas utilizadas para o ensaio foram: pH 10.5, NBD-Cl concentração 0.2% (m/v), volume do tampão 1, 5 mL, tempo de reacção 25min e temperatura 25ºC.

Figura 4: Efeito da quantidade de tampão (ml) na reacção da tiamina com NBD-Cl.tiamina (20µg / ml): 1 ml, Tampão de pH: 10.5, NBD-Cl conc. 0, 2% (M/v), Tempo de reacção 25 min.

Figura 5: Efeito da concentração de NBD-Cl na sua reacção com a tiamina.tiamina (20 µg / ml): 1 ml, tampão (pH 10, 5): 1, 5 ml, tempo de reacção 25 min.

validação do método

O método foi validado para os seguintes parâmetros:: especificidade, linearidade, precisão, precisão, limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), e robustez de acordo com as orientações da Conferência Internacional de harmonização (ICH).

Linearidade, limite de detecção (LOD) limite de quantificação (LOQ)

A linearidade foi avaliada através da análise de regressão linear, determinada pela construção de sete concentrações de tiamina, na faixa de 05–35µg/mL, a qual foi calculada pelo menos quadrado método de regressão para calcular a calibragem equação e o coeficiente de correlação. As curvas de calibração foram construídas traçando a concentração versus a absorvância, utilizando uma análise de regressão linear. A equação de regressão para os resultados foi A=0.033 x – 0.009 (r2=0.999), onde a é a absorvância a 434 nm, x é a concentração de tiamina em µg/mL na faixa de 05-35 µg/mL, e r é o coeficiente de correlação (Tabela 1). Verificou-se que a gama de concentrações lineares é comparável com o nosso método anterior utilizando NQS . O limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) foram determinados de acordo com a seguinte fórmula: LOD=3.3×SDa / b, E LOQ=10×SDa/b, SDa é o desvio-padrão da ordenada na origem; b é o declive segundo as orientações ICH . Verificou-se que o LOD e o LOQ eram de 0, 667 e 2, 020 µg/mL, respectivamente (Quadro 1).

Parâmetro	Valor
a Medição do comprimento de onda (nm)
faixa Linear (µg/mL)
equação de Regressão	y = 0.033 x – 0.009
Intercept
Standard deviation of intercept
Slope
Standard deviation of slope
Correlation coefficient (r2)
Limit of detection, LOD (μg/mL)
Limit of quant., LOQ (μg/mL)

Table 1: Parameters for the performance of the proposed method.a precisão do método proposto foi efectuada aplicando 3 concentrações diferentes de 10, 20 e 30 µg/mL de tiamina dentro de um intervalo linear calculado como a percentagem do fármaco recuperado das amostras (Quadro 2).

Sample No	Sample Content (µg/mL)	Thiamine Standard Amount (µg/mL)	Amount Found (Total) (µg/ml)	Recovery + SD*
				96.29+0.015
				98.90+0.018
				101.47+0.148

Table 2: Estudos de recuperação para a determinação da tiamina pelo método proposto.
*valores são médias de três determinações.

erro relativo (RE) foi de 0, 24%, com o correspondente desvio-padrão de 0, 004 para três determinações diferentes (quadro 3).

Sample No	Concentration (μg/mL)	Concentration Found (μg/mL)	Recovery (% + SD)	Relative Error (%)
			95.5±0.004
			96.46±0.002
			97.50±0.003

Tabela 3: Avaliação da exatidão e precisão.

robustez

mecanismo de reacção: foi relatado que a Cl-NBD reage com grupos aminos de derivados da amina primária ou secundária . Similarly, amino group of thiamine can act as a nucleophile due to the lone pair of electrons on the nitrogen atom, trending to attack on the electron-deficit center in NBD-Cl (Table 4 & Figure 6). Ao mesmo tempo, provou-se que a composição do produto é 1:1 de tiamina e NBD-Cl (Figura 7). Assim, conclui-se que o amino grupo da tiamina reage com NBD-Cl para formar um aduto castanho. A equação de reação é mostrada na Figura 7.

Figura 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

Parameter	Recovery (% ± SD)
Recommended condition	97.50±0.003
NBD-Cl concentration (0.22%)	98.75±0.002
NBD-Cl concentration (0.180%)	96.76%±0.003
Buffer PH(10.7)	96.90±0.002
Buffer PH(10.3)	95.79±0.22
o Tempo de Reação, min (23)	96.09±0.009
o Tempo de Reação, min (27)	98.01±0.003

Tabela 4: Influência da variação pequena no ensaio de condição de desempenho analítico da proposta de espectrofotométrica de método para determinação de Tiamina usando NBD-Cl reagente.a aplicação do método proposto à análise da forma de dosagem de tiamina os comprimidos de tiamina foram submetidos à análise pelo proposto e a alegação do rótulo concorda bem com o nosso novo método, tal como demonstrado no quadro 5. O método proposto tem a vantagem de estar praticamente isento de interferências por excipientes.

Brand Name of Label Claim (Mg)	Amount Found (Mg)	(% Found ± SD)a
Thiamine tablets (100 mg)		99.9±0.025

Table 5: Analysis of Thiamine-containing dosage form by the proposed method.
a: values are mean of five determinations.

Figure 7: Reacção da tiamina com NBD-Cl apresentando estequiometria de 1:1.