Przeprowadzanie HPLC

wprowadzenie

Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest zasadniczo wysoce ulepszoną formą chromatografii kolumnowej. Zamiast pozwolić rozpuszczalnikowi kapać przez kolumnę pod wpływem grawitacji, jest on wymuszany pod wysokim ciśnieniem do 400 atmosfer. To znacznie przyspiesza.

pozwala również na użycie znacznie mniejszej wielkości cząstek dla materiału opakowaniowego kolumny, co daje znacznie większą powierzchnię dla interakcji między fazą stacjonarną a cząsteczkami przepływającymi obok niej. Pozwala to na znacznie lepsze oddzielenie składników mieszaniny.

Inna istotna poprawa w stosunku do chromatografii kolumnowej dotyczy metod wykrywania, które można zastosować. Metody te są wysoce zautomatyzowane i niezwykle wrażliwe.

kolumna i rozpuszczalnik

Co mylące, w HPLC stosuje się dwa warianty w zależności od względnej polaryzacji rozpuszczalnika i fazy stacjonarnej.

normalna Faza HPLC

jest to zasadniczo to samo, o czym można już przeczytać w chromatografii cienkowarstwowej lub chromatografii kolumnowej. Chociaż jest opisany jako „normalny”, nie jest najczęściej stosowaną formą HPLC.

kolumna jest wypełniona drobnymi cząsteczkami krzemionki, a rozpuszczalnikiem jest np. niepolarny heksan. Typowa kolumna ma średnicę wewnętrzną 4,6 mm (i może być mniejsza) i długość od 150 do 250 mm.

związki polarne w mieszaninie przechodzącej przez kolumnę będą przyklejać się dłużej do polarnej krzemionki niż związki niepolarne. Niepolarne będą zatem szybciej przechodzić przez kolumnę.

Odwrócona Faza HPLC

w tym przypadku rozmiar kolumny jest taki sam, ale krzemionka jest modyfikowana tak, aby była niepolarna poprzez przyłączenie długich łańcuchów węglowodorowych do jej powierzchni-zazwyczaj z 8 lub 18 atomami węgla w nich. Stosuje się rozpuszczalnik polarny-na przykład mieszaninę wody i alkoholu, takiego jak metanol.

w tym przypadku nastąpi silne przyciąganie między rozpuszczalnikiem polarnym a cząsteczkami polarnymi w mieszaninie przechodzącej przez kolumnę. Nie będzie tak dużego przyciągania między łańcuchami węglowodorowymi przyłączonymi do krzemionki (Faza stacjonarna) a cząsteczkami polarnymi w roztworze. Polarne cząsteczki w mieszaninie spędzają więc większość czasu poruszając się z rozpuszczalnikiem.

związki niepolarne w mieszaninie mają tendencję do tworzenia się z grupami węglowodorowymi ze względu na siły dyspersji van der Waalsa. Będą one również mniej rozpuszczalne w rozpuszczalniku ze względu na konieczność zerwania wiązań wodorowych, gdy wyciskają się między cząsteczkami wody lub metanolu, na przykład. Dlatego spędzają mniej czasu w roztworze w rozpuszczalniku, a to spowolni ich w drodze przez kolumnę.

oznacza to, że teraz to cząsteczki polarne będą szybciej przemieszczać się przez kolumnę.

Odwrócona Faza HPLC jest najczęściej stosowaną formą HPLC.