Mediolan i pięć innych miast, a w październiku 1238 musiał podnieść oblężenie Brescii . W tym samym roku małżeństwo naturalnego syna Fryderyka Enzio z sardyńską księżniczką Adelazją i wyznaczenie Enzio na króla Sardynii, w którym papiestwo rościło sobie pretensje, doprowadziło do ostatecznego zerwania z papieżem. Grzegorz IX głęboko nie ufał Fryderykowi zarówno w sprawach religijnych, jak i politycznych: Fryderyk miał przypuszczać, że Mojżesz, Chrystus i Muhammad byli trzema oszustami, którzy sami zostali oszukani, a na arenie politycznej papież obawiał się, że Państwa papieskie zostaną odizolowane i otoczone, szczególnie dlatego, że w Rzymie powstała partia Pro-cesarska. Pod pretekstem, że cesarz zamierzał wypędzić go z Rzymu, Grzegorz ekskomunikował Fryderyka po raz drugi w Niedzielę Palmową, 20 marca 1239. Był to początek ostatniej fazy gigantycznej walki między papiestwem a cesarstwem; zakończyło się to śmiercią cesarza i upadkiem jego domu.

Fryderyk odparł ekskomunikę wieloma ważnymi manifestami, z których większość skomponował Pietro della Vigna, członek cesarskiej kancelarii, który miał wybitne dary literackie. Manifest podkreślał, że kardynałowie mieli uczestniczyć w kierowaniu Kościołem, a Fryderyk próbował nawet wywołać Solidarność wśród świeckich Książąt. Zintensyfikował jednak również działania wojenne w północnych Włoszech. W celu sfinansowania stale rosnącego zapotrzebowania na broń wprowadził gruntowną reorganizację administracyjną cesarskich Włoch (m.in. utworzenie 10 regencji) i Królestwa Sycylii. Ponadto zarządził rygorystyczną inwigilację ludności. W środkowych Włoszech podjął ofensywę, zajmując Marchię Ankonę i Księstwo Spoleto, a w lutym 1240 jego armia wkroczyła do państw papieskich i zagroziła Rzymowi. W ostatniej chwili jednak papież zdobył poparcie Rzymian.

Po klęsce floty genueńskiej ściągającej delegatów na Papieską Radę do Rzymu, ponad 100 wysokiej rangi duchownych-wśród nich kardynałów i biskupów—zostało wziętych jako jeńcy Fryderyka do Apulii. To zwycięstwo militarne okazało się jednak niekorzyścią polityczną: dostarczyło materiału do propagandy przedstawiającej Fryderyka jako prześladowcę kościoła.

będąc jeszcze obozem przed Rzymem, Fryderyk otrzymał wiadomość o śmierci papieża Grzegorza i wycofał się na Sycylię. W międzyczasie Mongołowie najechali Europę. Zostały one tymczasowo wstrzymane w niezwykle krwawej bitwie pod Liegnitz na Śląsku 9 kwietnia 1241, ale prawdopodobnie dopiero nagła śmierć ich przywódcy, wielkiego chana Ögödei, uniemożliwiła dalsze postępy Mongołów w tym czasie.

Po krótkim pontyfikacie Celestyna IV nastąpiło długie interregnum. Gdy w 1243 Innocenty IV został wybrany, Fryderyk, za namową Książąt niemieckich i króla Francji Ludwika IX, rozpoczął negocjacje z nowym papieżem. Porozumienie między papieżem a cesarzem wydawało się bliskie ewakuacji państw papieskich, gdy w czerwcu 1244 Innocenty uciekł z miasta. W Lyonie zwołał na rok 1245 Sobór i w lipcu tegoż roku obalił cesarza, przeszkodą dla pojednania był najwyraźniej status gmin lombardzkich.

bitwa pomiędzy cesarzem a papiestwem toczyła się w pełnej furii. Po stronie Papieskiej cesarz był napiętnowany jako prekursor Antychrysta; po stronie cesarskiej był okrzyknięty Mesjaszem. Cesarz poparł współczesne żądanie powrotu kościoła do ubóstwa i świętości wczesnochrześcijańskiej Wspólnoty i ponownie zaapelował do książąt Europy o przyłączenie się do Ligi obronnej przeciwko żądnym władzy prałatom. Większość Książąt pozostawała jednak neutralna i choć dwie kolejne Antyki Niemieckie otrzymywały niewielkie poparcie, cesarz stale tracił w Niemczech Grunt.

w maju 1247 planowana podróż Fryderyka do Lyonu w celu obrony własnej sprawy przed Radą papieską została przerwana przez powstanie strategicznie położonego miasta Parmy. W wyniku tej klęski znaczna część środkowych Włoch i Romanii została utracona. W następnym roku cesarz miał ponieść kolejne ciosy losu; Pietro della Vigna, przez wiele lat powiernik cesarza, został oskarżony o zdradę i popełnił samobójstwo w więzieniu. W maju 1249 król Sardynii Enzio, ulubiony syn Fryderyka, został pojmany przez Bolończyków i był więziony aż do swojej śmierci w 1272.

pozycja cesarza, zarówno we Włoszech, jak i—dzięki staraniom jego syna Konrada IV—w Niemczech, poprawiała się, gdy zmarł niespodziewanie w 1250 roku. Został pochowany w katedrze w Palermo obok swojej pierwszej żony, rodziców i normańskiego dziadka.

kiedy opublikowano wiadomość o jego śmierci, Cała Europa była głęboko wstrząśnięta. Pojawiły się wątpliwości, że naprawdę nie żyje; wszędzie pojawiały się fałszywe Fryderyki; na Sycylii rosła legenda, że został przeniesiony na wulkan Aetna; w Niemczech, że został zamknięty w górze i powróci jako ostatni cesarz, aby ukarać światowy kościół i pokojowo przywrócić Święte Cesarstwo Rzymskie. Uważano jednak, że nadal żyje w swoich spadkobiercach. W rzeczywistości jednak, w ciągu 22 lat po jego śmierci, wszyscy oni zginęli: ofiary bitwy z papiestwem, którą rozpoczął ich ojciec.