spektrofotometr skanujący z pojedynczą wiązką

istnieją dwie główne klasy urządzeń: pojedyncza wiązka i podwójna wiązka. Spektrofotometr z podwójną wiązką porównuje natężenie światła między dwiema ścieżkami światła, z których jedna zawiera próbkę referencyjną, a druga próbkę badaną. Spektrofotometr z pojedynczą wiązką mierzy względne natężenie światła wiązki przed i po wprowadzeniu próbki testowej. Chociaż pomiary porównawcze z instrumentów z podwójną wiązką są łatwiejsze i bardziej stabilne, instrumenty z pojedynczą wiązką mogą mieć większy zakres dynamiczny i są optycznie prostsze i bardziej kompaktowe. Dodatkowo, niektóre specjalistyczne instrumenty, takie jak spektrofotometry wbudowane w mikroskopy lub teleskopy, są instrumentami jednobiegunowymi ze względu na praktyczność.

historycznie spektrofotometry wykorzystują monochromator zawierający kratkę dyfrakcyjną do produkcji widma analitycznego. Krata może być ruchoma lub stała. W przypadku zastosowania pojedynczego detektora, takiego jak lampa fotopowielacza lub fotodioda, kratę można zeskanować krok po kroku (spektrofotometr skanujący), aby detektor mógł mierzyć natężenie światła przy każdej długości fali (która będzie odpowiadać każdemu „krokowi”). Można również stosować tablice detektorów (spektrofotometr TABLICOWY), takie jak urządzenia sprzężone z ładunkiem (CCD) lub tablice fotodiodowe (PDA). W takich układach krata jest stała, a natężenie każdej długości fali światła jest mierzone przez inny detektor w układzie. Ponadto większość nowoczesnych spektrofotometrów średniej podczerwieni wykorzystuje technikę transformacji Fouriera do pozyskiwania informacji spektralnej. Technika ta nazywana jest spektroskopią podczerwieni z transformacją Fouriera.

podczas dokonywania pomiarów transmisji spektrofotometr porównuje ilościowo ułamek światła przechodzącego przez roztwór odniesienia i roztwór testowy, a następnie elektronicznie porównuje natężenia dwóch sygnałów i oblicza procent transmisji próbki w porównaniu ze standardem odniesienia. W przypadku pomiarów współczynnika odbicia spektrofotometr ilościowo porównuje frakcję światła odbijającą się od próbek referencyjnych i badanych. Światło z lampy źródłowej jest przepuszczane przez monochromator, który rozprasza światło w” tęczę ” długości fal przez obracający się pryzmat i wysyła wąskie pasma tego rozproszonego widma przez mechaniczną szczelinę po stronie wyjściowej monochromatora. Pasma te są przesyłane przez próbkę badaną. Następnie gęstość strumienia fotonów (watów na metr kwadratowy Zwykle) światła przesyłanego lub odbitego mierzy się za pomocą fotodiody, urządzenia sprzężonego z ładunkiem lub innego czujnika światła. Wartość transmitancji lub odbicia dla każdej długości fali badanej próbki jest następnie porównywana z wartościami transmisji lub odbicia z próbki referencyjnej. Większość przyrządów zastosuje funkcję logarytmiczną do liniowego współczynnika przepuszczalności w celu obliczenia „chłonności” próbki, wartości, która jest proporcjonalna do „stężenia” mierzonej substancji chemicznej.

w skrócie, sekwencja zdarzeń w spektrofotometrze skaningowym jest następująca:

1. źródło światła jest świecone w monochromatorze, dyfrakowane w tęczę i dzielone na dwie wiązki. Następnie jest skanowany przez próbkę i roztwory referencyjne.
2. frakcje fal padających są transmitowane przez próbkę i odniesienie lub od nich odbijane.
3. powstałe światło uderza w urządzenie fotodetektorowe, które porównuje względne natężenie obu wiązek.
4. obwody elektroniczne zamieniają prądy względne na liniowe wartości procentowe transmisji i/lub wartości absorbancji / stężenia.

w spektrofotometrze macierzowym sekwencja jest następująca:

1. źródło światła jest świecone w próbce i skupione w szczelinie
2. przepuszczane światło jest załamywane w tęczę z kratką odbicia
3. powstałe światło uderza w urządzenie fotodetektora, które porównuje intensywność wiązki
4. obwody elektroniczne przekształcają prądy względne w liniowe procenty transmisji i/lub wartości absorbancji/stężenia

wiele starszych spektrofotometrów musi być skalibrowanych za pomocą procedury znanej jako „zerowanie”, aby zrównoważyć zerowy prąd wyjściowy dwóch wiązek w detektorze. Przekazywanie substancji odniesienia określa się jako wartość odniesienia, tak więc przekazywanie wszystkich innych substancji jest rejestrowane w stosunku do początkowej substancji „zerowanej”. Spektrofotometr przekształca następnie współczynnik transmisji na „chłonność”, czyli stężenie określonych składników badanej próbki w stosunku do substancji wyjściowej.

zastosowania w biochemiiedit

spektrofotometria jest ważną techniką stosowaną w wielu eksperymentach biochemicznych, które obejmują izolację DNA, RNA i białek, kinetykę enzymów i analizy biochemiczne. Ponieważ próbki w tych zastosowaniach nie są łatwo dostępne w dużych ilościach, szczególnie nadają się do analizy w tej nieniszczącej technice. Ponadto cenna próbka może być zapisana za pomocą platformy mikro-objętościowej, w której do kompletnych analiz wymagane jest zaledwie 1uL próbki. Krótkie wyjaśnienie procedury spektrofotometrii obejmuje porównanie chłonności ślepej próbki, która nie zawiera barwnego związku, z próbką zawierającą barwny związek. Barwienie to można uzyskać albo przez barwnik taki jak barwnik Coomasie Brilliant Blue g-250 mierzony przy 595 nm, albo przez reakcję enzymatyczną obserwowaną między β-galaktozydazą a ONPG (zmienia próbkę na żółtą) mierzony przy 420 nm.: 21-119 spektrofotometr służy do pomiaru barwnych związków w widzialnym obszarze światła(między 350 nm a 800 nm),: 65, dzięki czemu można go wykorzystać do znalezienia więcej informacji na temat badanej substancji. W eksperymentach biochemicznych wybiera się właściwości chemiczne i / lub fizyczne, a stosowana procedura jest specyficzna dla tej właściwości, aby uzyskać więcej informacji o próbce, takich jak ilość, czystość, aktywność enzymu itp. Spektrofotometria może być używana do wielu technik, takich jak wyznaczanie optymalnej absorbancji długości fali próbek, określanie optymalnego pH dla absorbancji próbek, określanie stężeń nieznanych próbek i określanie pKa różnych próbek.:Spektrofotometria 21-119 jest również pomocnym procesem oczyszczania białek i może być również stosowana jako metoda tworzenia optycznych testów związku. Dane spektrofotometryczne mogą być również używane w połączeniu z równaniem Beera-Lamberta, a = − log 10 ⁡ T = ϵ C l = O D {\textstyle a=-\log _{10}t=\epsilon cl=od}

, w celu określenia różnych zależności między przepuszczalność i koncentracja oraz absorbancja i koncentracja.:21-119 ponieważ spektrofotometr mierzy długość fali związku poprzez jego kolor, można dodać substancję wiążącą barwnik, aby mogła ulec zmianie koloru i zostać zmierzona. Możliwe jest poznanie stężeń dwuskładnikowej mieszaniny za pomocą widm absorpcji standardowych roztworów każdego składnika. Aby to zrobić, konieczne jest poznanie współczynnika ekstynkcji tej mieszaniny przy dwóch długościach fal i współczynników ekstynkcji roztworów, które zawierają znane masy obu składników. Spektrofotometry zostały opracowane i ulepszone przez dziesięciolecia i były szeroko stosowane wśród chemików. Ponadto Spektrofotometry są wyspecjalizowane do pomiaru wartości absorbancji fali UV lub światła widzialnego.: 21-119 jest uważany za bardzo dokładny instrument, który jest również bardzo czuły i dlatego niezwykle precyzyjny, szczególnie w określaniu zmiany koloru. Ta metoda jest również wygodna w użyciu w eksperymentach laboratoryjnych, ponieważ jest to niedrogi i stosunkowo prosty proces.