Faza ruchoma

Faza ruchoma w chromatografii odwróconej jest mieszaniną wody lub buforu z polarnym rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak metanol, acetonitryl, izopropanol (IPA) lub tetrahydrofuran (THF). Siła elucji wzrasta mniej więcej w tej kolejności. Alkohole są donorami protonów, podczas gdy acetonitryl jest akceptorem protonów. Mieszaniny acetonitrylu i wody mają niższą lepkość w porównaniu z mieszaninami innych rozpuszczalników z wodą. Powoduje to niższe ciśnienie wsteczne. Mieszaniny IPA / woda mają najwyższą lepkość. Ze względu na niższe przeciwciśnienie, które wynika z niższej lepkości, dwoma powszechnie stosowanymi organicznymi modyfikatorami fazy ruchomej są acetonitryl i metanol. Ponadto acetonitryl ma niską absorpcję w niskim UV, znacznie mniej niż inne rozpuszczalniki.

woda jest najsłabszym eluentem w chromatografii odwróconej fazy. Dodatek metanolu lub acetonitrylu zmniejsza retencję. Logarytm współczynnika retencji zmniejsza się mniej więcej proporcjonalnie do stężenia rozpuszczalnika organicznego. Jeśli analit jest małą cząsteczką, jak ma to miejsce w przypadku większości leków, retencja zmniejszy się około siedmiokrotnie, gdy stężenie metanolu w fazie mobilnej wzrośnie o około 20%. W wielu okolicznościach (np. w rozwoju metody) zakłada się, że istnieje liniowa zależność między logarytmem współczynnika retencji a ułamkiem objętościowym modyfikatora organicznego w fazie ruchomej. Należy jednak uważać to za dobrą zasadę, która nie jest ani dokładna, ani teoretycznie uzasadniona.

ze względu na właściwości solwatacyjne acetonitrylu w porównaniu z metanolem, wymiana jednego rozpuszczalnika na drugi często powoduje zmianę kolejności elucji analitów (fig.2). Dlatego technika ta jest często stosowana w opracowywaniu metod. Zmiana z jednego modyfikatora na inny powoduje bardziej znaczące zmiany selektywności niż zmiana samej wytrzymałości rozpuszczalnika (tj. poprzez zmianę po prostu stężenia rozpuszczalnika organicznego). THF drastycznie zmienia również selektywność. W rzeczywistości największe zmiany selektywności są często spowodowane przez zastąpienie niektórych metanolu lub acetonitrylu THF. Jednak z kilku powodów, takich jak nieprzyjemny zapach, tworzenie się nadtlenków i niekorzystna przezroczystość UV, nie jest używany bardzo często.

Rysunek 2. Wpływ modyfikatora fazy ruchomej na selektywność separacji. Góra, acetonitryl, dół, metanol. Kolumna: XTerra RP18, 4,6 mm×50 mm, 3,5 µm. Gradient przy 2 ml min-1 przez 15 min od 0 do 80% organicznych przy pH 3 z mrówczanem amonu. Anality: 1, triamteren; 2, chlortalidon; 3, althiazide; 4, furosemid; 5, benztiazide; 6, probenecyd; 7, kwas etakrynowy; 8, bumetanid; 9, kwas kanrenowy. (Chromatogram dostarczony przez Diane Diehl i Kim Tran, Waters Corporation.)

interpretacja selektywności rozpuszczalnika jest skomplikowana przez fakt, że rozpuszczalnik organiczny jest adsorbowany przez ligandy fazy stacjonarnej i można go uznać za część fazy stacjonarnej. Ostatnio kilku autorów zmierzyło nadmiar powierzchni organicznych modyfikatorów dla standardowych stacjonarnych faz typu C18 i odkryło znaczące różnice w solwacji powierzchniowej między acetonitrylem a metanolem.

na początku tej sekcji wspomniano, że metanol zapewnia większą retencję niż acetonitryl. Jest to jeszcze bardziej widoczne dla związków zjonizowanych niż dla związków nieujonizowanych. Ma to sens z punktu widzenia, że adsorbowany metanol w fazie stacjonarnej ułatwia przenikanie zjonizowanych cząsteczek do fazy stacjonarnej. Ten sam wzór występuje, gdy metanol jest porównywany z THF. Są to przydatne funkcje w rozwoju metod. Z drugiej strony związki z grupami funkcyjnymi sulfonamidu wykazują stosunkowo większą retencję w THF, w porównaniu z grupą analitów referencyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, znaczący wpływ rozpuszczalnika organicznego na selektywność separacji można zaobserwować, ale racjonalizacja jest trudna, ponieważ rozpuszczalnik można znaleźć zarówno w fazie stacjonarnej, jak i mobilnej. Niektórzy autorzy podjęli również próbę odróżnienia faz ruchomych o wysokiej zawartości wody od faz o niskiej zawartości wody.

jak wspomniano powyżej, istotne różnice selektywności między różnymi rozpuszczalnikami są bardzo użytecznym narzędziem w rozwoju separacji odwróconych faz. Klasyczne schematy rozwoju metody wykorzystywały metanol, acetonitryl i THF jako modyfikatory organiczne w fazie mobilnej. Selektywność pośrednią można uzyskać za pomocą mieszanin rozpuszczalników, a bez trudności można uzyskać regulację odstępu między pikami. Nowoczesne Schematy rozwoju metod wykorzystują temperaturę jako kolejną łatwo kontrolowaną zmienną w dostosowaniu selektywności.

ważnym aspektem selektywności fazy ruchomej jest jej pH. bardzo ważna jest kontrola zatrzymywania związków jonizowalnych za pomocą buforów lub dodatków kwasowych lub zasadowych do fazy ruchomej. Rozsądnie wybierając pH fazy mobilnej, można ułatwić manipulację retencją i selektywnością. Jak wspomniano powyżej, różnica w retencji między zjonizowaną i niejonizowaną formą analitu może być 10 do 30-krotna, a kontrola pH jest ważna.

w ostatnich latach badania wykazały, że zarówno pH, jak i stałe jonizacji buforu ulegają zmianie, gdy dodaje się do niego rozpuszczalniki organiczne. Ma to istotne konsekwencje dla kontroli zatrzymywania. Zwykle można uzyskać zdefiniowaną jonizację analitu, jeśli pH fazy ruchomej jest oddalone o ±2 jednostki pH od pKa analitu. Ale jeśli pH i PKA analitu zmieniają się wraz z dodatkiem rozpuszczalnika organicznego, nie jest łatwo poradzić sobie z prostymi zasadami. Dlatego dobra kontrola pH i dobry bufor są ważnymi elementami odtwarzalności odwróconej separacji fazowej jonizowalnych analitów. PH jest mierzone w wodzie, gdzie jest się zaznajomionym z wartościami pKa powszechnie stosowanych buforów i woli się trzymać blisko tych wartości pKa. Maksymalna pojemność bufora znajduje się w pKa bufora. Podczas gdy pH zmienia się w obecności rozpuszczalnika organicznego, pojemność bufora nie. Dla praktyków chromatografii odwróconej jest to ważny aspekt kontroli retencji. Z drugiej strony badacz mechanizmów retencji w fazie odwróconej musi być przygotowany do pomiaru pH w obecności rozpuszczalnika organicznego, aby w pełni zrozumieć jego wpływ na retencję. Zazwyczaj dodanie rozpuszczalnika organicznego powoduje wzrost pKa kwasów i zmniejszenie pKa zasad. Dotyczy to zarówno buforów, jak i analitów. Może to spowodować znaczne przesunięcie oczekiwanego wzoru jonizacji analitu. Oto przykład, który ilustruje to: Amina o pKa 9 jest całkowicie zjonizowana w buforze fosforanowym przy pH 7 w wodzie, ale może być tylko w połowie zjonizowana w tym samym buforze po dodaniu 70% metanolu. Oczywiste jest, że takie efekty są znaczące. Dlatego dokładny sposób przygotowania buforu i kontrolowania jego pH jest niezbędny do dobrej kontroli retencji w odwróconej fazie jonizowalnych analitów.

inne interakcje jonowe wpływają również na retencję i selektywność odwróconej separacji fazowej zjonizowanych analitów. Klasycznym narzędziem zwiększającym retencję analitów jonowych jest chromatografia jonowo-parowa. W tej technice Faza stacjonarna jest równoważona z hydrofobowym Jonem naładowanym, takim jak Jon kwasu sulfonowego o długim łańcuchu (np. oktylosulfonian) lub hydrofobową czwartorzędową aminą (np. jon tetrabutyloamoniowy). Typowe stężenie w fazie ruchomej wynosi około 10 mM. dodanie odczynnika pary jonowej do fazy ruchomej zwiększa retencję jonów docelowych, zmniejsza retencję jonów o tym samym ładunku co odczynnik pary jonowej i pozostawia retencję neutralnych analitów, w tym zwitterionów, prawie nienaruszoną. Jest to zatem doskonałe narzędzie do regulacji selektywności separacji. Powodem tych zmian w selektywności jest fakt, że odczynnik pary jonów jest adsorbowany na powierzchni fazy stacjonarnej. Najprostszą interpretacją powstałego mechanizmu retencji jest połączenie wymiany jonowej z mechanizmem odwróconej fazy. Wraz ze wzrostem stężenia odczynnika pary jonowej w fazie ruchomej, zatrzymywanie przeciwstawnie naładowanych analitów zwiększa się początkowo, a następnie obniża się przy wyższych stężeniach. W przypadku odczynników par jonowych o różnej długości łańcucha retencja wzrasta szybciej przy dłuższej długości łańcucha.

innym efektem oddziaływania jonów spotykanym z kationowymi analitami jest wzrost retencji, gdy do fazy ruchomej dodawane są małe nieorganiczne przeciw-jony. Wymagane stężenia są zwykle około 10-krotnie wyższe niż stężenia stosowane w przypadku odczynników z parą jonów. Typowymi anionami tego typu są nadchloran (ClO4−), tetrafluoroboran (BF4−) lub heksafluorofosforan (PF6−). Znacznie zwiększają retencję kationowych analitów. Efekt jest bardziej wyraźny w przypadku acetonitrylu jako dodatku w fazie ruchomej niż w przypadku metanolu. Tłumaczy się to grubszą warstwą acetonitrylu adsorbowanego na fazie stacjonarnej w porównaniu z monomolekularną warstwą metanolu i podziałem przeciwjonu na tę warstwę. Z punktu widzenia użytkowników zachowanie retencyjne kationowych analitów w obecności tych anionów nieorganicznych nie różni się od obserwowanego z prawdziwymi odczynnikami pary jonowej, tj. z długołańcuchowymi kwasami sulfonowymi.