diagnoza

diagnostyka kliniczna: obraz kliniczny pacjentów cierpiących na zakażenie chlamydialne może być mylący, ponieważ do 70-80 procent zakażonych kobiet i 50 procent zakażonych mężczyzn są bezobjawowe. Zazwyczaj kobieta z nieskomplikowaną infekcją chlamydialną przedstawi bezzapachową, śluzowatą wydzielinę z pochwy bez świądu. Dyzuria bez częstotliwości lub pilności będzie skarżył się, jeśli cewka moczowa jest zaangażowany. Ponadto w PID można wywołać silny ból brzucha w wywiadzie z wysoką gorączką, dyspareunią, przedłużającymi się cyklami miesiączkowymi i krwawieniem międzymensturalnym. Podczas badania z os widać zapalenie szyjki macicy z żółtą, mętną, śluzowatą wydzieliną. Szyjka macicy ma tendencję do łatwego krwawienia po zeskrobaniu szpachelką lub szczotką. Badanie moczu ujawni obecność >5 WBC/HPF (high power field), co sugeruje zapalenie cewki moczowej13. Zakażenia chlamydialne nie można odróżnić klinicznie od innych zakażeń cewki moczowej. Test aminowy (tj., znaczne wydzielanie zapachu po dodaniu KOH do wydzieliny pochwy) może pomóc odróżnić infekcje chlamydialne od innych infekcji dolnych dróg rodnych, ale ma niską swoistość.

zakażenie Chlamydial u mężczyzn objawia się jako zapalenie cewki moczowej w 15-55 procent dotkniętych mniej niż lub równe 35 lat, czasami zapalenie najądrza może być seen2. Łagodne do umiarkowanego jasne do białego absolutorium cewki moczowej jest postrzegane rano przed pacjentem puste przestrzenie. W zapaleniu najądrzy może wystąpić jednostronny ból jąder z rumieniem moszny, tkliwością lub obrzękiem najądrza. Diagnozę można ustalić na podstawie obecności wydzieliny mukopurulentnej z prącia, która na barwieniu grama wykazuje >5 WBC/HPF i braku wewnątrzkomórkowych diplokoków Gram-ujemnych. Zespół Reitera może być rzadkim powikłaniem nieleczonej infekcji chlamydialnej. Reaktywne zapalenie stawów, które obejmuje triadę zapalenia cewki moczowej / zapalenie szyjki macicy u kobiet, zapalenie spojówek i bezbolesne wykwity mukoopurulentne na dłoniach i podeszwach stóp, obserwuje się w zespole Reitera29. Częściej atakowane są samice niż samce. Występuje asymetryczne Wiązanie wielu stawów z upodobaniem do kończyn dolnych.

diagnostyka laboratoryjna: bezobjawowy charakter choroby i rosnące spektrum zakażeń wywołanych przez C. trachomatis podkreślają potrzebę stosowania wrażliwych i wiarygodnych metod laboratoryjnych.

biegłość w pobieraniu i transporcie próbek ma kluczowe znaczenie dla dokładności w badaniach diagnostycznych. Wykazano, że zarówno czułość, jak i swoistość testów diagnostycznych dla C. trachomatis są bezpośrednio związane z adekwatnością próbki. Komórki gospodarza, które portują organizm, powinny zostać włączone do kolekcji próbek, ponieważ chlamydiae są obligatoryjnymi patogenami wewnątrzkomórkowymi, zwłaszcza w technikach obejmujących bezpośrednią wizualizację organizmu.

wybór miejsc pobierania próbek może wpływać na prawdopodobieństwo odzyskania patogenu. Zaobserwowano 10-20% wzrost odzysku C. trachomatis z dróg rodnych, Jeśli pobrano zarówno próbki szyjki macicy, jak i cewki moczowej w porównaniu tylko z pobraniem próbek szyjki macicy42. Wymaz endokerwisowy, wymaz z pochwy/dopochwowy, wymaz ze sromu, wymaz z cewki moczowej i odbytnicy oraz pobrany pierwszy mocz są częstymi próbkami pobieranymi od pacjentek. Wymaz z cewki moczowej i odbytnicy oraz pierwsza próbka moczu mogą być również pobierane od pacjentów płci męskiej oprócz innych specyficznych próbek, takich jak płyn sterczowy.

zapewnienie jakości pobierania i transportu próbki: odpowiedniość próbki można określić poprzez wizualizację komórek squamo-kolumnowych podczas mikroskopii. Okaz uważa się za odpowiedni, jeśli zawiera jedną kolumnową/metaplastyczną komórkę na szkiełko. Prawdopodobieństwo izolacji jest zoptymalizowane, jeśli próbka jest chłodzona natychmiast po pobraniu w temperaturze 2-8°C. czas między pobraniem próbki a przetworzeniem powinien być idealnie krótszy niż 48 godzin, jeśli nie jest to możliwe, mogą one zostać zamrożone w temperaturze -70 °C do czasu przetworzenia 16. Surowica bydlęca płodowa (2-5%) pomaga zachować żywotność chlamydiae w próbce, która ma być zamrożona. 2-molowy fosforan sacharozy (2-MSP) lub glutaminian sacharozy są najczęściej stosowanym środkiem transportowym. Opracowano i zatwierdzono do celów diagnostycznych syntetyczne nośniki transportowe do hodowli oraz niektóre testy niekulturowe, tj. nośnik transportowy M4, nośnik Flex Trans oraz nowy nośnik syntetyczny/uniwersalny M4.

diagnostyka laboratoryjna chlamydii składa się z następujących metod:

(i) testy specyficzne

hodowla komórkowa: izolacja organizmu jest ostateczną metodą diagnozowania zakażenia chlamydialnego. Chlamydia jest obligatoryjnym patogenem wewnątrzkomórkowym i dlatego do hodowli wymaga zarodkowego jaja kurzego lub linii komórek zwierzęcych. Takie metody hodowli są trudne technicznie, pracochłonne, uciążliwe i kosztowne i nie zostały powszechnie przyjęte jako rutynowe badanie wykonywane w ogólnych laboratoriach klinicznych. Jednakże, trzy systemy in vitro zostały wykorzystane do hodowli chlamydiae mianowicie. szczepienie myszy (dootrzewnowe, wewnątrzczaszkowe i dożylne), szczepienie pęcherzyka żółtkowego (szczepienie pęcherzyka żółtkowego zarodka piskląt w wieku 7-8 dni) oraz linie hodowli komórkowej16. Do najczęściej stosowanych linii komórkowych należą-komórki HeLa 229, komórki McCoya, komórki BHK21 i komórki BGMK24.

wrażliwość hodowli komórkowej na izolację chlamydiae zwiększa się przez wstępne traktowanie komórki przez polikacje, DEAE-dekstrans, odwirowanie inokulum na jednowarstwę komórkową i włączenie antymetabolitów, takich jak cykloheksymid lub cytochalazyna B do podłoża hodowli komórkowej42. Monowarstwy komórkowe do hodowli C. trachomatis hoduje się w fiolkach bębnowych lub muszlowych na szklanych pokrywach lub w studzienkach naczyń do hodowli wielokomórkowej. Metoda fiolki z powłoką jest bardziej wrażliwa dla próbki klinicznej niż hodowla komórkowa z wieloma komórkami ze względu na mniejsze ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego42. Przed szczepieniem próbka powinna być poddana działaniu ultradźwięków, aby zakłócić komórki gospodarza i oddzielić inkluzje chlamydialne. W celu zaszczepienia hodowli komórkowych należy usunąć podłoże hodowlane leżące nad podłożem hodowlanym i zastąpić je wystarczającą ilością próbki w podłożu transportowym hodowlanym, aby pokryć jednowarstwę i zapobiec wysuszeniu.

najczęściej stosowanym pożywką wzrostu jest pożywka Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) uzupełniona aminokwasami i witaminami, surowica cielęca płodu (5-10), dodatkowa glukoza (0,056 m) i 2-glutamina42. Po zaszczepieniu Kultury inkubuje się w temperaturze 37o C przez 2-3 dni. Inkluzje chlamydialne są następnie obserwowane przez immunofluorescencyjne zabarwienie. Wykazano, że czułość izolacji waha się w granicach 70-85% w zależności od laboratorium i zastosowanego systemu hodowli. Tradycyjnie jest to” złoty standard ” w diagnostyce C. trachomatis, ponieważ jest w 100% specyficzny42. Niestety, jest poza możliwościami większości prywatnych i publicznych laboratoriów ze względu na zapotrzebowanie techniczne, pracochłonność i wysokie koszty.

bezpośredni Test fluorescencyjny (Dfa): Test DFA dodaje znaczną zaletę specyficznego barwienia przeciwciała chlamydii do bezpośredniego badania próbki i pozostaje jedną z najbardziej użytecznych technik diagnostycznych. W tym teście stosuje się szybką identyfikację ciał elementarnych w rozmazach z przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z izotiocynatem flouresceiny (FITC – Mab) przeciwko MOMP lub specyficznym dla rodzaju LPS. Ciała elementarne pojawiają się jako wyraźne, ostro zarysowane, jabłkowo zielone cząstki o kształcie dysku (300 nm), a ciała siateczkowate pojawiają się około trzy razy większe niż ciała elementarne posiadające fluorescencyjne halo.

procedura ta nie wymaga surowych warunków transportu próbki, ponieważ rozmaz od strony łoża jest przygotowywany, a następnie transportowany do przetworzenia. Przy zastosowaniu MOMP C. trachomatis stwierdzono, że czułość i swoistość DFA wynosi odpowiednio 80-90% i 98-99% w stosunku do kultury43. Wysoką specyficzność DFA przypisuje się jego zależności od wizualizacji charakterystycznej morfologii i cech barwienia inkluzji chlamydialnych. Dfa jest jedynym dostępnym testem diagnostycznym, który pozwala na jednoczesną ocenę adekwatności próbki poprzez wizualizację komórek nabłonkowych obecnych w rozmazie. Jest to szybkie i proste (czas realizacji Około 30 min), ale badanie mikroskopowe i interpretacja wyników wymaga specjalistycznej wiedzy. Metoda ta jest zatem zalecana w laboratoriach o małej objętości. Test ten można również zastosować do miejsc pozagenitalnych. Stwierdzono, że jest on bardziej wrażliwy niż hodowla na wykrywanie chlamydii w próbkach endometrium lub jajowodów42.

ELISA (test immunoenzymatyczny): Test ELISA jest dostępny do wykrywania antygenu C. trachomatis. Do tego celu dostępnych jest kilka dostępnych na rynku zestawów ELISA. Większość z nich wykrywa CHLAMYDIAL LPS, który jest bardziej rozpuszczalny niż MOMP. Stwierdzono, że testy immunoenzymatycznego testu (EIA) wykazują czułość 62-96% i swoistość 86-99% w porównaniu z hodowlą komórkową44. Test ten jest odpowiedni dla laboratoriów bez dostępu do hodowli komórkowej. Jednak różne duże i małe badania na całym świecie, w tym w Indiach, wykazały słabą czułość ELISA w porównaniu do DFA i PCR45,46,47.

cytologia: cytologia jest łatwo dostępnym, prostym w użyciu i ekonomicznym testem diagnostycznym. Nie wymaga środków ostrożności przy przechowywaniu i transporcie próbek, można również wykryć cząstki nieżywotne/niezakaźne. Jakość próbki klinicznej można ocenić za pomocą techniki mikroskopowej, a procedury techniczne stosowane w tych badaniach są zwykle szybsze i prostsze do wykonania niż kultura. Najczęściej stosuje się metody Giemsa, immunoflourescencji i barwienia jodem. Inne plamy, takie jak immunoperoksydaza, immunoferrytyna, maja, Giemenez, Macchiavello i pomarańcza akrydowa, mogą być również stosowane do wykrywania inkluzji chlamydialnej w złuszczonych komórkach. Obecność inkluzji wewnątrzcytoplazmatycznych jest patogonomiczna dla chlamydialnych zakażeń oczu u noworodków, jednak ta metoda nie jest zalecana do diagnozowania zapalenia spojówek lub zakażenia narządów płciowych u dorosłych z powodu braku wrażliwości. Spośród trzech metod Immunofluorescencja oferuje najwyższą czułość, a następnie Giemsa, a następnie barwienie jodem42.

metody molekularne: Tradycyjne metody diagnozowania mają kilka ograniczeń, które obejmują niską czułość, długi czas testowania i wysokie koszty. Dlatego opracowywane są testy oparte na bezpośrednim rozpoznaniu sekwencji DNA i RNA. Komercyjnie dostępną sondą DNA do wykrywania chlamydii jest test PACE 2 (Probe Assay Chemiluminescence Enhanced) 48, zdolny do wykrywania również Neisseria gonorrhoeae, który jest nieizotopową sondą DNA do wykrywania określonych części r-RNA C. trachomatis w próbce endokerwialnej i cewkowej. Opracowano również inną sondę DNA, test PACE 2C, która jednocześnie wykrywa zarówno C. trachomatis, jak i N. gonorrhoeae z jednego okazu; jednak przed zastosowaniem w diagnostyce wymagana jest dalsza ocena PACE 2C. Badania te wykorzystują chemiluminescencyjną sondę DNA, która hybrydyzuje do specyficznej dla gatunku sekwencji chlamydialnej 16S rRNA. Po utworzeniu hybrydy DNA-rRNA jest ona adsorbowana na kulce magnetycznej i reakcja chemiluminescencyjna jest wykrywana ilościowo za pomocą luminometru. Ponieważ aktywne dzielenie chlamydiae zawiera do 104 kopii 16S rRNA, test PACE 2 powinien być teoretycznie bardziej wrażliwy niż systemy detekcji antygenu. Czułość PACE 2 w stosunku do standardu amplifikacji DNA nie została jeszcze dobrze oceniona, ale w jednym badaniu odnotowano 77 do 93% 48.

rozwój testów opartych na technologii amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT) był najważniejszym postępem w dziedzinie diagnostyki chlamydialnej, ponieważ techniki hodowli komórek in vitro zastąpiły woreczek żółtkowy do hodowli i izolacji organizmu z próbek klinicznych. NAAT jest co najmniej o 20-30% bardziej wrażliwy (zdolny do wykrycia zaledwie jednej kopii genu) i 100% specyficzny49,50. Oferuje możliwość wykorzystania nieinwazyjnych próbek, takich jak mocz, do przesiewania infekcji u osób bezobjawowych, które normalnie nie szukałyby opieki klinicznej. Jest to krytyczna zaleta, ponieważ większość zakażeń chlamydialnych u kobiet i znaczna część zakażeń u mężczyzn są bezobjawowe. Najbardziej znaną z technologii amplifikacji DNA jest PCR. PCR może być rodzajem, gatunkiem, grupą lub szczepem specyficznym w zależności od projektu podkładu. Geny ukierunkowane na rozpoznanie C. trachomatis to gen MOMP, endogenny plazmid, Gen fosfolipazy oraz Gen 16S i 23s rRNA. Ponieważ wszystkie technologie amplifikacji kwasów nukleinowych wykrywają cele związane z kwasami nukleinowymi, nie zależą one ani od żywotności, ani od nienaruszonego stanu organizmu docelowego, aby uzyskać pozytywny wynik. W związku z tym transport próbki nie jest kwestią krytyczną49. Chociaż nie zostało to dobrze zbadane, „okno” dla ujemnego w hodowli, pozytywnego stanu PCR po leczeniu doksycykliną wydaje się trwać do 3 wk29. Po tym czasie osobniki chore stają się zarówno hodowlane, jak i PCR ujemne.

test PCR do wykrywania C. trachomatis opracowany przez Roche Diagnostics w Bazylei (Roche-Amplicor) był pierwszym testem PCR zatwierdzonym przez FDA w Stanach Zjednoczonych51. Od 1993 r.Amplicor PCR był stosunkowo dobrze oceniany zarówno dla próbek moczowo-płciowych, jak i moczu, z ogólną czułością i swoistością odpowiednio od 90 do 99 do 100% 51. Amplicor PCR jest zatwierdzony dla szyjki macicy, męskiej cewki moczowej i męskiej próbki moczu.

wraz z eksplozją technik biologii molekularnej nowsze testy, takie jak system M2000 (Abbott), a także Amplification strand-displacement (SDA) (BD ProbeTec strand displacement amplification opracowany przez Becton Dickinson and Company, Diagnostic Systems, Franklin Lakes, NJ) i transcription-mediated amplification (TMA) (system APTIMA firmy Gen-Probe, Inc., San Diego) stał się Dostępny dla C. trachomatis. Chociaż popularne w krajach rozwiniętych, ich wysokie koszty początkowe i utrzymania uniemożliwiają ich wykorzystanie w Warunkach ubogich w zasoby.

brzemię C. organizmy trachomatis w drogach rodnych (ładunek chlamydialny) mogą być wykrywane za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym i mogą wahać się od 10 do ponad miliona organizmów/ml wydzieliny z dróg rodnych 52. Może to mieć wpływ na wydajność różnych testów amplifikacji kwasów nukleinowych, które rutynowo nie rozróżniają osób o wysokich i niskich obciążeniach chlamydialnych. Stwierdzono, że różnice w obciążeniu chlamydialnym związane są z występowaniem objawów klinicznych, przenoszalnością i utrzymywaniem się zakażenia oraz ryzykiem rozwoju przewlekłych następstw53. Stąd, tam jest krytyczna rola kwantyfikacji w diagnostyce i leczeniu zakażeń chlamydialnych.

NAAT są najbardziej czułymi testami do badań przesiewowych i diagnostycznych zakażeń chlamydialnych i gonokokowych układu płciowego54,55,56. Zgłaszano jednak wątpliwości co do ich skuteczności na obszarach o niskim wskaźniku rozpowszechnienia57,58. W 2002 r. CDC zaleciło potwierdzenie wszystkich pozytywnych Naat dla C. trachomatis, gdy dodatnia wartość prognostyczna testu wynosi <90% 59. Jednak prawdziwa specyfika metod NAAT wynosi >99% 54,55.

CDC zasugerowało również kilka możliwych strategii potwierdzania59, które obejmują (i) badanie drugiej próbki z innym NAAT o równej lub wyższej czułości na pierwszy test, (ii) wykonanie innego NAAT o równej lub wyższej czułości na pierwszy test ukierunkowany na inną sekwencję kwasu nukleinowego na oryginalnej próbce, (iii) powtórzenie oryginalnego testu na oryginalnej próbce oraz (iv) przywrócenie pacjenta do ponownego badania.

jednak opisane ograniczenia polegają na tym, że większość klinicystów nie pobiera dwóch próbek do tej samej oceny, ani nie jest możliwe sprowadzenie pacjenta w celu pobrania innej próbki, a większość laboratoriów nie ma urządzeń / możliwości wykonania dwóch różnych Naat.

koncepcja badania potwierdzającego nie jest nowa57. Jednak; komplikuje obsługę próbki dodatniej NAAT i dodaje koszty do już kosztownego testu przesiewowego. Ponadto nadal istnieje miejsce na poprawę czułości Naat, być może poprzez lepsze przygotowanie próbki, automatyzację lub stężenie docelowe.

(ii) testy niespecyficzne

test esterazy leukocytów (LE) jest szybkim testem testowym do stosowania z próbkami moczu. Test ten jest przeznaczony do wykrywania zakażeń dróg moczowych poprzez wykrywanie enzymu wytwarzanego przez komórki polimorfonuklearne (PMN). Dodatnie wyniki testu LE występują w przypadku zakażeń wywołanych przez wiele różnych czynników, w tym C. trachomatis i N. gonorrhoeae.

czułość testu LE do wykrywania zakażenia C. trachomatis waha się w szerokim zakresie od 31 do 100%, a specyficzność w zakresie od 83 do 100% 60. Test LE został uznany za najlepszy test przesiewowy dla młodzieńczych mężczyzn i, według większości doniesień, nie powinien być stosowany do testowania próbek od kobiet lub starszych mężczyzn ze względu na niezadowalającą wydajność.

(iii) testy Rapid point of care (POC)

szybkie testy, zwane również testami „point-of-care” Dla C. trachomatis wykorzystują technologię EIA w formatach opartych głównie na wychwytywaniu błon lub immunodyfuzji lateksu. Szybkie badania wykonywane są w gabinetach lekarskich, nie wymagają zaawansowanego sprzętu i mogą być zakończone w około 30 minut. Wyniki są odczytywane wizualnie, a zatem są jakościowe. Chociaż kilka zestawów jest dostępnych na rynku, ale żaden nie został dobrze oceniony. Ogólnie rzecz biorąc, szybkie testy są znacznie mniej czułe i specyficzne niż badania laboratoryjne. W porównaniu z PCR, czułość i swoistość testu Clearview (Unipath Ltd., UK) wynosiły odpowiednio 53,8 i 99,1% w przypadku wymazów endokerwisowych oraz 31,1 i 95,2% w przypadku wymazów z pochwy pochodzących od Filipińczych61. Szybkie testy oferują przewagę nad konwencjonalnymi testami laboratoryjnymi tylko wtedy, gdy wyniki są wymagane natychmiast do zarządzania pacjentem. Szybkie testy nie powinny być stosowane w populacji o niskiej częstości występowania lub u osób bezobjawowych ze względu na możliwość uzyskania fałszywie dodatnich wyników. Wyniki szybkiego testu powinny być zawsze uważane za przypuszczalne, a jeśli są pozytywne, powinny być potwierdzone testem wykonanym laboratoryjnie.

podsumowując, chociaż kultura jest specyficzna w 100%, jej szacowana czułość może wynosić nawet 50%. Większość laboratoriów odeszło od kultury ze względu na związane z tym koszty, czas i trudności techniczne. Tak więc, zamiast kultury jako diagnostycznego złotego standardu, Rozszerzony złoty standard / zdefiniowany standard odniesienia, tj. powszechnie zgodny wynik z dwoma technikami spoza kultury jest uważany za użyteczny jako narzędzie badawcze43.

(iv) serologia

testy serologiczne nie są na ogół przydatne w diagnostyce zakażeń dróg rodnych wywołanych przez C. trachomatis. Przeciwciała wywołane przez C. zakażenie trachomatis jest długotrwałe, a dodatni wynik testu na obecność przeciwciał nie odróżnia poprzedniego od obecnego zakażenia.