materiał roślinny

obserwacje i analizy chemiczne przeprowadzono w latach 2011-2018 na kolekcji roślin uprawianych w ogrodzie eksperymentalnym na kampusie Uniwersytetu Louvain-la-Neuve (50°39’55″N; 4°37’11″E). Przed i w okresie kwitnienia (Lipiec–Sierpień) rośliny umieszczano w komorach wzrostu Uniwersytetu w kontrolowanych warunkach (24/22 °C; 16 L: 8D, RH 80 ± 10%).

Materiał owadobójczy

główne gatunki owadów A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum I B. terrestris) zostały wykorzystane w badaniach atrakcyjności kwiatów i preferencji smakowych. Osobniki A. mellifera I B. pascuorum (10 na test i leczenie) zebrano na wolności wokół kampusu uniwersyteckiego (minimum cztery miejsca na gatunek) rano przed testami. Jako B. osobniki terrestris nie można łatwo odróżnić w terenie (podobna morfologia dla kilku gatunków), użyliśmy trzmieli z czterech uli (Biobest, Westerloo, Belgia) umieszczonych w pobliżu budynków uniwersyteckich, aby pozyskać osobniki do eksperymentów.

cechy kwiatowe

liczba pyłków

pylniki 10 kwiatów w fazie męskiej i żeńskiej zebrano, policzono, wysuszono i umieszczono na sitku (90 µm), aby przetrzeć w celu zebrania ziaren pyłku. Zważono ilość ziaren pyłku. Badania pyłków przeprowadzono na Uniwersytecie w Lille-1 (Jednostka Evo-Eco-Paleo). Użyliśmy licznika cząstek do oszacowania liczby ziaren pyłku w tych próbkach. Dzień przed liczeniem pyłków próbki umieszczano w grzejniku rurowym, aż większość etanolu odparowała. Następnie wymusiliśmy osuszanie pnia, umieszczając próbki w piecu w temperaturze 56 °C przez noc. Do każdej próbki pyłku dodaliśmy 1 mL wody destylowanej. Rury następnie sonikowano i wirowano, aby oddzielić ziarna pyłku od pylników i siebie nawzajem. Roztwór pyłku (200 µL) rozcieńczono następnie w 5 mL izotonicznego buforu pomiarowego (Casy® ton). Licznik cząstek przeanalizował trzy próbki o objętości 400 µL z zawiesiny pyłku, zapewniając całkowitą liczbę cząstek w tej objętości 1200 µL, a także liczbę dla 400 klas wielkości w zakresie od 0,125 do 150 µm. Porównania z próbkami ślepymi pozwoliły zidentyfikować piki cząstek o wielkości od 20 do 30 µm, co odpowiada ziarnom pyłku. Liczbę ziaren pyłku na pylnik oszacowano przez pomnożenie wartości podanych przez licznik cząstek przez współczynnik rozcieńczenia (tj. (1000/200) × (5000 + 200)/1200).

kolor i morfologia kwiatów

mierzyliśmy cechy kwiatowe (długość korony, średnica korony, kolor kwiatów i współczynnik odbicia UV) na 10 kwiatach na fazę (od 10 różnych osobników). Szerokość hełmu, długość korony i średnicę mierzono za pomocą suwmiarki. Spektrum odbicia barw tepal mierzyliśmy za pomocą spektrometru światłowodowego (Avaspec-ULS2048) i źródła światła ksenonowego (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Holandia). Do pomiarów współczynnika odbicia UV kwiaty mocowano na czarnym tle i fotografowano aparatem Nikon D40 (Coastal Optical 60 mm 1:4 UV-VIS-ir ApoMacro; Filtre X-Nite 330).

Floral volatile collection

pobraliśmy lotne związki organiczne (voc) z nienaruszonych kwiatów fazy męskiej i żeńskiej (N = 4 dla każdej fazy). Każdy kwiat był indywidualnie wkładany do szklanej bańki (50 mm długości i 30 mm średnicy), z otworem o średnicy 17 mm. Aby zapobiec zanieczyszczeniu powietrza, do jednego końca szklanej żarówki podłączono jedną Teflonową rurkę wypełnioną aktywnym węglem drzewnym, a do drugiego-dwie szklane rurki Tenax TA (6 mm × 4 mm, 7 cali; 60-80 mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgia). Rury Tenax podłączono do skalibrowanych pomp powietrza (Gilair plus, Sensidyn, St.Petersburg, USA) z szybkością przepływu 50 mL·min−1 przez 180 minut (między 11:00 a 14:00). Warunki laboratoryjne wahały się od 21,5 do 23,5 °c z 45 do 55% RH.

uwięzione LZO następnie poddano termicznemu desorbowaniu na chromatografie gazowym Agilent 6800 wyposażonym w agregat Termodesorpcyjny Gerstel TDU i kriokomorze CIS utrzymywanym w temperaturze -50 °C. bezpośrednio po termodesorpcji agregat CIS T° zaprogramowano w zakresie od -50 °C do 300 °C w temperaturze 12 °C sec−1. Aparat GLC sprzężono ze spektrometrem masowym Agilent 7975 C. Warunki analityczne były następujące: Wtrysk w trybie dzielonym (ze współczynnikiem podziału 50:1, Hel w 1,6 mL min-1 jako gaz nośny), kolumna VF-Max MS 30 m x 250 µm (DF = 0,25 µm) (Agilent). Program temperaturowy pozwalający na najlepszą separację (nie przedstawiono badań wstępnych) ustalono w następujący sposób: 40 °C (5 min), następnie do 75 °C przy 4 °C min−1 i do 115 °C (3 °C min−1) i ostatecznie do 250 °c przy 13 °C min−1. Warunki MS były następujące: Tryb EI przy 70 eV, źródło T° = 250 °C, kwadrupol MS przy 200 ° C, zeskanowany zakres masy od 35 do 500 amu.

zarejestrowane chromatogramy były systematycznie interpretowane w celu poszukiwania LZO specyficznych dla faz męskich lub żeńskich. Po wykryciu cząsteczki zostały zidentyfikowane zgodnie z obliczeniowymi bazami danych (Wiley 250.L i PAL 600). Identyfikacja została potwierdzona na podstawie danych retencyjnych czystych cząsteczek dostępnych w handlu. Oznaczono je również ilościowo w stosunku do wysoce czystego wzorca wewnętrznego (limonen, 1 µL roztworu metanolu przy 0.67 µg µL1 dodawane automatycznie do każdej probówki desorpcyjnej przed procesem termicznym).

powietrze otoczenia było również zbierane jako kontrola w celu identyfikacji zanieczyszczeń tła. Aby zapobiec ewentualnemu przebiciu, drugi szklany wkład obciążony tym samym adsorbentem (Tenax TA) był systematycznie umieszczany w tandemie. Analiza nie wykazała żadnych śladów interesujących cząsteczek.

zbieranie i analizy alkaloidów

pylniki zebrano z 50 kwiatów (od 10 osobników), wysuszono, a następnie rozdrobniono na sicie (90 µm) w celu zebrania ziaren pyłku. Trzy replikaty 15 mg pyłku pobrano na alkaloidy. Próbki zamrażano (-80 °C) przez 2 godziny, a następnie liofilizowano. Suche próbki mielono na drobny proszek ciekłym azotem, a zważone ilości proszku umieszczano w 1,5-mL probówce z mikrocentryfugą (Eppendorf, Hamburg, Niemcy). Alkaloidy ekstrahowano za pomocą homogenizatora tkankowego (VWR Ultrasonic Cleaner) przez 10 minut w 100 µL buforu ekstrakcyjnego (70% wodnego metanolu i 0,5% kwasu mrówkowego). Po odwirowaniu przy 12 000 obr. / min przez 5 min (Wirówka 5430 R) supernatant przeniesiono do probówki mikrokomórkowej o pojemności 1,5 mL. Po wysuszeniu w SpeedVac, alkaloidy zawieszono w 200 µL metanolu klasy LC-MS i przesączono filtrem strzykawkowym PTFE o grubości 0,45 µm (Whatman).

nektar zebrano w 5-µL szklanych rurek kapilarnych (Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Niemcy) z 50 kwiatów (od 10 osobników). Trzy replikaty 15 µL nektaru suszono w SpeedVac i zawieszono w 200 µL metanolu klasy LC-MS przed filtracją za pomocą filtra strzykawkowego PTFE 0,45 µm (Whatman).

analizy chemiczne przeprowadzono przy użyciu systemu LC-MS/MS składającego się z pompy Thermo Accela, autosamplera, detektora fotodiodowego oraz detektora masy Thermo Scientific LTQ orbitrap XL (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Woluwe, Belgia). Zastosowano kolumnę Phenomenex Gemini C18 (2 mm × 150 mm, wypełnioną cząsteczkami 3 µm). Zastosowano dwuskładnikowy układ rozpuszczalnikowy o natężeniu przepływu 300 µL min−1: rozpuszczalnik a, woda klasy HPLC (0,1% kwas mrówkowy); i rozpuszczalnik B, metanol klasy LC-MS (0 min: 95% A, 10-12 min: 0% a, 13-17 min: 95% a). Wstrzyknięto 10-µL objętości i temperaturę kolumny ustawiono na 30 °C. wysokiej rozdzielczości MS przeprowadzono za pomocą źródła jonizacji elektroopryskowej w trybie dodatnim. Zastosowano następujące warunki wlotowe: temperatura kapilary 275 °C; Napięcie kapilary 13 V; soczewka tuby 140 V; przepływ gazu osłonowego 30 J.A. oraz przepływ gazu pomocniczego 10 J.a. pozyskiwanie i przetwarzanie danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania Xcalibur. Metoda ta obejmowała zakres masy wszystkich alkaloidów (MW od 329 do 673). Alkaloidy z pyłku i nektaru zostały wykryte i wstępnie zidentyfikowane przez SM o wysokiej rozdzielczości. Fragmentacja uzyskana w wyniku dysocjacji wywołanej kolizją pomogła w identyfikacji. Stężenia alkaloidów obliczono na podstawie standardowej krzywej akonityny w MeOH i wyrażono jako”równoważnik akonityny”. Analizowane alkaloidy wyselekcjonowano na podstawie ich obecności u innych gatunków Aconitum4, 8.

produkcja nektaru i skład cukru

nektar zebrano w szklanych probówkach kapilarnych o pojemności 5 µL (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Niemcy) z kwiatów roślin przenoszonych w komorach wzrostu na terenie kampusu uniwersyteckiego (bez wizyt owadów). Na początku antezy oszacowaliśmy trend produkcji nektaru w ciągu dnia, pobierając próbki 2 kwiatów od 12 osób co 2 godziny w ciągu 10 godzin. Mierzyliśmy również całkowitą produkcję nektaru na kwiat (2 Kwiaty od 12 osobników) dla tych samych kwiatów co 2 dni w ciągu całego (9 dni) okresu życia kwiatów, o tej samej porze każdego dnia, 2 godziny po włączeniu światła. Całkowitą produkcję dla faz męskich i żeńskich oszacowano na podstawie próbek pobranych na koniec fazy męskiej (5 dni po wykonaniu antezy) i żeńskiej (8 dni).

próbki nektaru przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analiz chemicznych. Po wyprowadzeniu, identyfikację cukru i oznaczanie ilościowe przeprowadzono metodą GC-MS (Thermo Trace 1310 / Thermo ISQ-QD). Zastosowano kolumnę Restek RXI-5SIL MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 µm DF). Natężenie przepływu wynosiło 1,0 mL min−1 (Hel). Współczynniki podziału wstrzyknięte wynosiły 1/10 dla heksoz i 1/100 dla sacharozy. Zastosowano następujące warunki wlotowe: temperatura pieca, 105 °C przez 4 min, następnie do 280 °C przy 15 °C min−1 (przez 20 min) i temperatura wtryskiwacza 250 °C.Całkowitą zawartość cukru w nektarze na kwiat (mg) obliczono następnie jako objętość nektaru (µL) x całkowite stężenie cukru (mg/µL).

zachowanie owadów

w 2011 i 2012 roku przeprowadzono badania w czterech pozostałych naturalnych populacjach w fens w Południowej Belgii. Spośród nich Rezerwat przyrody” Les Abattis”(49°40’50″N; 5°32’59” E) zawiera największą i najgęstszą populację (2970 m2 z 1330 ± 1030 A. napellus flowers m−2). Na „Fouches”(49°4’8″N; 5°43’06” E), który ma drugą co do wielkości populację (1788 m2), osobniki A. „chantemelle „(49°39′ 37″N; 5°39’37″E)” miały nieciągłą populację składającą się z trzech łat (161, 423 i 500 m2) o stosunkowo niskiej gęstości roślin i kwiatów (179 ± 125 kwiatów m−2). „Sainte−Marie” (49°40’06″N; 5°32’56″E) miała niewielką i niejednorodną populację (292 m2, 152 ± 163 m2) rozciągającą się około 150 m wzdłuż dawnego toru kolejowego.

odwiedziny kwiatów odnotowano w 10-minutowych obserwacjach podczas szczytowego kwitnienia przez trzy kolejne dni w 2011 roku (między 30 sierpnia a 3 września) i przez cztery dni w 2012 roku (między 21 a 27 sierpnia) przy suchych i ciepłych warunkach pogodowych. Udział męskich kwiatów fazowych w tych dniach i we wszystkich populacjach był wyższy niż żeńskich kwiatów fazowych (około 85%). Kwiaty w promieniu 1 m2 (lub około pięciu roślin) obserwowano w tym samym czasie. Przeprowadzono co najmniej dziesięć obserwacji na populację (maksymalnie 16), rozłożonych na całe populacje i w różnych porach dnia. Dla każdego odwiedzającego odnotowaliśmy gatunki, liczbę zrabowanych i niezbrojonych kwiatów odwiedzanych na roślinę i łaty, czas spędzony na jednym kwiecie, a także ich zachowania żerowe (zbieranie pyłku lub nektaru, legalna lub nielegalna wizyta, określana jako rabunek (praca bazowa, rabunek pierwotny i wtórny). Podczas 530 min obserwacji kwiatów w 2011 r.i 400 min w 2012 r. odnotowaliśmy 183 odwiedzających kwiaty. Trzmiele (B. pascuorum I B. hortorum) i pszczoły miodne (Apis mellifera) były głównymi gośćmi kwiatów; zaobserwowano tylko 3 osobniki B. terrestris.

zdolność przenoszenia pyłków

trzydzieści osobników na gatunek zabito octanem etylu i pojedynczo składowano. Pyłek usunięto z różnych części ciała owadów za pomocą małych kostek żelatyny-gliceryny53. Ziarna pyłku skoncentrowane w korbiku zostały usunięte i nie zostały włączone do analiz. Wszystkie ziarna pyłku policzono mikroskopią świetlną.

czystość zbierania pyłków

pobraliśmy próbki pyłków od trzmieli odwiedzających A. napellus w naturalnych populacjach. W laboratorium próbki pyłków poddano acetolizacji53. Co najmniej 400 losowo wybranych ziaren pyłku z każdego z 25 ładunków pyłku zidentyfikowano i policzono w mikroskopie świetlnym.

smakowe odpowiedzi odwiedzających owady

postępowaliśmy zgodnie z protokołem Ma i wsp.54 do wykrywania akonityny. Po złapaniu poszczególne pszczoły były głodowane przez 3 godziny w plastikowej fiolce (7 cm długości, 2,8 cm średnicy wewnętrznej) w temperaturze pokojowej i w całkowitej ciemności w laboratorium. Przenieśliśmy każdą pszczołę do rurki trzymającej, rurki wirówki o pojemności 15 mL z wywierconym na końcu otworem o średnicy 4 mm i zamocowanym w środku kawałkiem stalowej siatki. Po wstępnej fazie testu z kroplą sacharozy, przedstawiliśmy badany roztwór w szklanej rurce kapilarnej o pojemności 100 µL i delikatnie ściskaliśmy rurkę, aby utrzymać roztwór na końcu rurki. Każdy owad bez rozszerzenia proboscis po 5 minutach został usunięty z badania. Fazy testowe trwały 2 minuty, a objętość roztworu przed i po teście była rejestrowana za pomocą suwmiarki.

testy przeprowadzono na trzech gatunkach odwiedzających (A. mellifera, B. pascuorum I B. terrestris). Z każdym roztworem zbadano dziesięć osobników każdego gatunku owadów. Stężenia sacharozy (430 µg mg-1) i akonityny (232 µg g−1) odpowiadały stężeniom występującym u naszego gatunku. Przedstawiono trzy roztwory: samą wodę dejonizowaną (kontrolną), czysty roztwór sacharozy oraz sacharozę i roztwór akonityny.

dla wszystkich testów obliczono wskaźnik odstraszania dla każdego pacjenta od wyboru napoju, objętości zużytego roztworu i czasu kontaktu z roztworem w następujący sposób: ID = 1 – (wybór dla sacharozy/wybór dla sacharozy + akonityny) × (objętość spożywana sacharozy/objętość spożywana sacharozy + akonityny) × (czas kontaktu z roztworem sacharozy/czas kontaktu z roztworem sacharozy + akonityny).

analizy statystyczne

normalność danych oszacowano za pomocą testów Shapiro–Wilka, a homoscedastyczność za pomocą testów Levene ’ a. Po spełnieniu wymagań normalności i homoscedastyczności przeprowadzono analizy wariancji (ANOVAs) (wpływ fazy kwiatowej na substancje lotne kwiatowe). W przeciwnym razie przeprowadzono testy nieparametryczne przy użyciu testu Wilcoxona w celu porównania dwóch warunków (wpływ fazy kwiatowej na morfologię kwiatów i parametry nektaru) i testu Kruskalla-Wallisa w celu porównania więcej niż dwóch warunków (wpływ owadów i roztworu na spożywaną objętość i czas kontaktu z roztworem w eksperymentach smakowych, wpływ owadów na zachowanie odwiedzin) oraz testów chi-square w celu porównania procentów osób w eksperymentach smakowych. Następnie przeprowadzono analizy ANOVA i nieparametryczne, porównując parowo więcej niż dwa warunki. Wszystkie analizy zostały przeprowadzone w SAS Enterprise Guide 7.1. Dane są prezentowane jako średnie ± odchylenia standardowe.