GDF11PRO-Fc wiąże się zarówno z GDF11, jak i MSTN

, aby pokazać, że GDF11PRO-Fc może sekwestruj aktywny dojrzały dimer gdf11 poprzez bezpośrednią interakcję, staraliśmy się zidentyfikować interakcję białko-białko między gdf11 i gdf11pro-FC. Dodatkowo, ze względu na zbliżoną homologię strukturalną dimerów GDF11 i Mstn, chcieliśmy również ustalić, czy GDF11PRO-Fc kojarzy się z mstn. Aby zidentyfikować te interakcje białko-białko, wykonaliśmy zestaw testów ciągnących (rys. 1). Ligandy rgdf11, rMSTN i ractivina a inkubowano z frakcjami lizatu z komórek hek293 transfekowanych plazmidem kodującym GDF11PRO-Fc lub MPRO-Fc przy pH 7,4. Dzięki sprzężonym fragmentom Fc na zmodyfikowanych propeptydach frakcje mogły być ściągane bezpośrednio na żywicę agarozową białka a / G. Zgodnie z oczekiwaniami GDF11PRO-Fc skutecznie zlikwidował zarówno rGDF11, jak i RMSTN, wskazując, że GDF11PRO-Fc był zdolny do wiązania obu ligandów. Ponadto MPRO-Fc skutecznie zlikwidowało zarówno rGDF11, jak i rMSTN. Zarówno GDF11PRO-Fc, jak i MPRO-Fc nie były w stanie ściągnąć bardziej dystalnie spokrewnionego ligandu nadrodziny TGF-β, ractiviny a, co wskazuje, że Wiązanie ligandu jest specyficzne (Fig. 1). Nie stwierdzono wiązania GDF11PRO-Fc, MPRO-Fc, rGDF11, rMSTN ani ractiviny A na kontrolnej żywicy agarozowej bez białka a/G. Z tych wyników wnioskujemy, że GDF11PRO-Fc spontanicznie łączy się z dojrzałymi DIMERAMI GDF11 i mstn przy fizjologicznym pH.

GDF11PRO-Fc współpracuje z GDF11 i MSTN. Interakcje białko-białko pomiędzy GDF11PRO-Fc lub MPRO-Fc a rGDF11, rMSTN lub ractiviną A oznaczano metodą pull-down. GDF11PRO-Fc lub MPRO-Fc inkubowano z rGDF11, rMSTN lub ractiviną A przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Zespolone FC kompleksy białkowe oddzielono na żywicy agarozowej powlekanej białkiem a/G, A eluaty prowadzono na 12% żelu SDS-PAGE w Warunkach redukujących i sondowano western blot. Kontrola wejściowa stanowiła 5% materiału wejściowego. WB western blot

GDF11PRO-bloki FC atrofia wywołana przez GDF11/MSTN w miotubach C2C12

wcześniej wykazano, że dodanie rGDF11 i rMSTN do zróżnicowanych miotuby wywołuje atrofię u mysich C2C12 i pierwotnych ludzkich szkieletów MYOTUBES . Po ustaleniu, że GDF11PRO-Fc wiąże GDF11 i Mstn, zapytaliśmy następnie, czy GDF11PRO-Fc może zapobiec atrofii wywołanej przez GDF11/Mstn w zróżnicowanych miotubach C2C12. Aby to osiągnąć, spakowaliśmy sekwencję DNA kodującą GDF11PRO-Fc do kapsydu AAV6, aby wygenerować wektor AAV6-GDF11PRO-Fc. W tych eksperymentach wybrano wektor AAV6 ze względu na jego zdolność do efektywnego i selektywnego transdukowania zróżnicowanych miotub C2C12, ale nie mioblastów . Mioblasty C2C12 hodowano i różnicowano przez 5 dni przed leczeniem Aav6-GDF11PRO-Fc lub AAV6-EGFP (wektor kontrolny)przy MOI 105 (Fig . 2A). Zgodnie z oczekiwaniami, ekspresja GFP była obserwowalna w miotubach C2C12 zakażonych AAV6-EGFP w 48-72 h po zakażeniu, a kwantyfikacja zinternalizowanych kopii genomu wektora na diploidalny Genom w 72 h po zakażeniu wskazywała, że transdukcja wektora została odpowiednio osiągnięta (Fig. 2b i c).

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Siedemdziesiąt dwie godziny później, miotuby naprawiono i zabarwiono w celu analizy immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała rozpoznającego dystrofinę (rod 22 / rod 23) w celu zobrazowania błon obwodowych myotube i dapi w celu zabarwienia jąder (Fig. 2d). Zmniejszenie wskaźnika różnicowania, definiowanego jako odsetek jąder włączonych do miotub, obserwowano u miotub leczonych rGDF11 (− 15%, p = 0,0008) lub rMSTN (− 14%, P = 0,0013) w stosunku do nieleczonej grupy kontrolnej. Efekt ten został jednak stłumiony w przypadku mięśniaków C2C12 z ekspresją GDF11PRO-Fc leczonych rGDF11 (−1,9%; p = 0.0047, w porównaniu z kontrolą poddaną działaniu rGDF11) lub rMSTN (− 3,0%; P = 0,0040, w porównaniu z kontrolą poddaną działaniu rMSTN; Fig. 2e). Ponadto, miotuby C2C12, które były leczone AAV6-GDF11PRO-Fc, opierały się atrofii wywołanej rGDF11 lub rmstn. Stwierdzono znaczne zmniejszenie średniej średnicy rurki w porównaniu z grupą kontrolną u miotub leczonych rGDF11 (− 39%; 0,0002) lub rMSTN (− 35%; P = 0,0003) w porównaniu z grupą kontrolną. Przeciwnie, miotuby wyrażające GDF11PRO-Fc traktowane rGDF11 (− 1,8%; P = 0,0005, w porównaniu do grupy kontrolnej leczonej rgdf11) lub rMSTN (- 5,3%; p = 0.0075, w porównaniu z grupą kontrolną poddaną działaniu rMSTN) w dużym stopniu nie ulegały zmianie (ryc. 2f i g). W osobnym eksperymencie GDF11PRO-Fc nie był w stanie zapobiec atrofii mięśniowej wywołanej ractiviną A, co jest zgodne z obserwacją, że GDF11PRO-Fc Nie wiąże aktywiny a (dodatkowy plik 1: Rysunek S3).

leczenie rGDF11 lub rMSTN wiązało się również z mniejszym odsetkiem dojrzałych mięśniaków z większą liczbą jąder, co sugeruje hamowanie różnicowania mięśniaków. Miotuby z więcej niż 11 mionukleami stanowiły tylko 5,2% (p = 0,0215) i 7,2% (p = 0.0328) analizowanych miotub w komórkach leczonych odpowiednio rGDF11 i rMSTN. Dla porównania, miotuby z więcej niż 11 jądrami stanowiły 26% miotub analizowanych w myotubach kontrolnych. W przypadku miotub z ekspresją GDF11PRO-Fc, które były leczone rGDF11 lub rMSTN, odsetek miotub z więcej niż 11 jąder wynosił odpowiednio 22% (P = 0,0104, w porównaniu z grupą kontrolną leczoną rGDF11) i 19% (P = 0,0404, w porównaniu z grupą kontrolną leczoną rMSTN) (Fig. 2h). Wreszcie, zgodnie z oczekiwaniami po sygnalizacji GDF11 / MSTN w ActRII, wzrost poziomu fosforylowanego białka SMAD2 /3 (pSMAD2 / 3) w miotubach leczonych AAV6-EGFP i RGDF11 lub rMSTN można było zaobserwować na western blot 24 godziny po dodaniu ligandu (Fig . 2i). Ten wzrost poziomu pSMAD2/3 był nieobecny w miotubach leczonych AAV6-GDF11PRO-Fc, co sugeruje, że ekspresja GDF11PRO-Fc antagonizuje indukowaną GDF11/MSTN aktywację SMAD2 / 3 w zróżnicowanych miotubach. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują, że GDF11PRO-Fc był w stanie zapobiec atrofii mięśniowej wywołanej rGDF11 i rmstn oraz hamowaniu różnicowania w komórkach C2C12.

zlokalizowana ekspresja GDF11PRO-Fc indukuje przerost mięśni szkieletowych u dorosłych myszy

wcześniej wykazaliśmy, że układowe dostarczanie genu gdf11pro-Fc przez wektor AAV u noworodków myszy prowadziło do znacznego wzrostu tempa wzrostu mięśni szkieletowych . Jednak z tego badania nie było jasne, czy GDF11PRO-Fc po prostu zwiększył wzrost mięśni szkieletowych lub faktycznie wywołał przerost mięśni szkieletowych. Ponadto nie było możliwe określenie, czy wpływ GDF11PRO-Fc był spowodowany lokalną blokadą GDF11/Mstn w mięśniach szkieletowych lub czy obserwowane efekty były spowodowane modulacją ogólnoustrojową GDF11/Mstn. Aby odpowiedzieć na te pytania, oceniliśmy Wpływ podawania domięśniowego AAV9-GDF11PRO-Fc u dorosłych myszy C57BL / 6J. W badaniach tych wstrzyknięto tylko prawostronną tylną kulę, a jako kontrolę zastosowano kontralateralną lewostronną kulę tylną.

masa ciała wzrosła nieznacznie w czasie u myszy leczonych AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 10% po 10 tygodniach; P = 0,0418; Fig. 3A). Ponadto, siła chwytu pojedynczej kończyny znormalizowana do masy ciała znacznie wzrosła w obu kończynach testowanych indywidualnie, z większą siłą działania obserwowaną w leczonych tylnych kończynach prawostronnych (+37%; p = 0,0177), chociaż zaobserwowano również znaczny wzrost znormalizowanej siły chwytu w nieleczonych tylnych kończynach lewostronnych (+ 18%; p = 0,0426). Różnica ta nie osiągnęła jednak znaczenia, gdy oba kończyny tylne były badane jednocześnie (+15%; P = 0,2375; Fig. 3b). Dziesięć tygodni po podaniu wektora, prawa strona tylna była wyraźnie większa u myszy leczonych AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3c). U myszy leczonych AAV9-GDF11PRO-Fc masa mokrej tkanki prawego przedniego kości piszczelowej (+50%; p = 0,0046) i gastrocnemiusa (+ 37%; P = 0,0023) była istotnie większa w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą nośnik. Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w masie mokrej tkanki nieleczonych mięśni tylnych lewej strony (Fig. 3d). Analiza powierzchni mięśniowej wykazała wzrost średniego obszaru przekroju poprzecznego mięśni (+15%; p = 0.0078) w aav9-GDF11PRO-Fc-wstrzykiwany po prawej stronie gastrocnemius (rys. 3e i f). Analiza rozkładu MFD ujawniła również przesunięcie w kierunku większych włókien mięśniowych w prawym boku myszy gastrocnemius wstrzykniętych AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3g), co wskazuje, że zlokalizowana ekspresja GDF11PRO-Fc wywołała przerost mięśni. W oddzielnej kohorcie oceniliśmy również wpływ zlokalizowanego dostarczania genu GDF11 przez domięśniowe wstrzyknięcie AAV9-GDF11 w prawą stronę tylną, a znaczący zanik mięśni zaobserwowano 10 tygodni po leczeniu w wstrzykniętym tylnym (dodatkowy plik 1: Rysunek S4).

Analiza Western blot wykazała, że białko GDF11PRO-Fc uległo ekspresji w prawym wstrzykniętym gastrocnemiusie aav9-GDF11PRO-Fc (pasmo 58 kDa; Fig. 3h). Jednakże, GDF11PRO-Fc nie był wykrywalny w nieleczonym lewostronnym gastrocnemiusie w tej samej całkowitej ilości załadowanego białka, co sugeruje, że większość ekspresji GDF11PRO-Fc mięśni szkieletowych była zlokalizowana w prawym tylnym wstrzyknięciu (dane nie pokazane). GDF11PRO-Fc był również wykrywalny w wątrobie przez Western blot, wskazując, że doszło do pewnej ekspozycji ogólnoustrojowej (Fig. 3h). Obserwację tę można najprawdopodobniej przypisać wyciekowi naczyniowemu wektora AAV9 do krążenia ogólnoustrojowego z miejsca wstrzyknięcia . Na podstawie tych danych ustalamy, że GDF11PRO-Fc indukuje przerost mięśni szkieletowych u dorosłych myszy. Dodatkowo, efekty te są przynajmniej częściowo pośredniczone przez lokalną blokadę GDF11 / MSTN na mięśnie szkieletowe, prawdopodobnie poprzez hamowanie interakcji ligandu z ActRII na tkankę mięśni szkieletowych.

systemowe dostarczanie genu GDF11PRO-Fc zwiększa masę i siłę mięśni szkieletowych u myszy mdx

następnie oceniliśmy wpływ ogólnoustrojowej ekspresji GDF11PRO-Fc u myszy mdx, aby określić, czy GDF11PRO-Fc może również wywoływać przerost i zwiększać siłę dystroficznych mięśni szkieletowych. Do celów tego badania, konstrukcję GDF11PRO-Fc zmodyfikowano mutacją, aby uczynić ją nieprzepuszczalną dla endogennego rozszczepiania metaloproteinazy podobnej do BMP1/TLD (GDF11PRO-Fc D122a) i zwiększyć trwałość czynnika w krążeniu ogólnoustrojowym . Do tych eksperymentów oceniano zarówno AAV9-GDF11PRO-Fc, jak i AAV9-GDF11PRO-Fc D122A w celu ustalenia, czy zmutowany transgen d122a doprowadziłby do wyraźniejszego efektu in vivo. W celu uzyskania ekspresji ogólnoustrojowej myszy mdx leczono wektorem lub nośnikiem poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej. Po podaniu dożylnym wektor AAV9 przenika wątrobę myszy z wysoką wydajnością. Transdukowane hepatocyty mogą następnie wyrażać transgen i wydzielać produkt białkowy do krążenia ogólnoustrojowego .

począwszy od 3 tygodni po wstrzyknięciu, zaobserwowaliśmy znaczny wzrost masy ciała, który utrzymywał się przez czas trwania badania z zastosowaniem leczenia AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 7,7% po 12 tygodniach; p = 0,0094) i AAV9-GDF11PRO-Fc D122a (+ 11% po 12 tygodniach; P = 0,006) (ryc. 4a). Należy zauważyć, że ze względu na patologię dystroficzną myszy mdx zwykle wykazują kompensacyjny przerost mięśni, który może częściowo maskować wzrost masy mięśniowej wywołany ekspresją GDF11PRO-Fc. W odniesieniu do testów czynności mięśni, leczone myszy wykazywały zwiększoną siłę chwytu kończyn przednich, nawet po normalizacji do masy ciała. Jednak różnica w znormalizowanej sile chwytu kończyn przednich osiągnęła znaczenie statystyczne dopiero w grupie AAV9-GDF11PRO-Fc D122a. Po 12 tygodniach od leczenia średnia znormalizowana siła chwytu kończyn przednich wzrosła odpowiednio o + 28% (P = 0,0873) i + 36% (P = 0,0248) u myszy leczonych AAV9-GDF11PRO-Fc i AAV9-GDF11PRO-Fc D122a (Fig. 4B). Wydajność Rotarod poprawiła się również przez leczenie aav9-GDF11PRO-Fc D122a średnio (+93% wzrost czasu opóźnienia rotarod; p = 0,0127). Wydajność Rotarod została również poprawiona w grupie Aav9-GDF11PRO-Fc, ale ta różnica nie osiągnęła istotności statystycznej (+44% wzrost czasu opóźnienia rotarod; P = 0,2835; Fig. 4c). Nie zaobserwowano różnic w czasie bieżni w żadnej z grup (ryc. 4d).

na końcu 12-w badaniu tygodniowym przerost mięśni był rażąco widoczny u leczonych myszy (fig. 5A). Średnie masy mokrej tkanki przedniej kości piszczelowej, brzusznej i mięśnia czworogłowego były zwiększone o + 17% (p = 0,0472), + 20% (p = 0,0011) i + 14% (P = 0.0333), odpowiednio w grupie AAV9-GDF11PRO-Fc. W grupie AAV9-GDF11PRO-Fc D122a wartości te były dodatkowo zwiększane do + 26% (p = 0,0030), + 31% (p = 0,0003) i + 23% (P = 0,0009) w porównaniu z grupą kontrolną leczoną nośnikiem dla zmiany średniej masy przedniej kości piszczelowej, masy gastrocnemiusa i masy mięśnia czworogłowego. Ponadto wilgotna masa tkanki przeponowej została zwiększona odpowiednio o + 19% (p = 0,0162) i + 26% (p = 0,0014) w grupach AAV9-GDF11PRO-Fc i AAV9-GDF11PRO-Fc D122a. Co ciekawe, masa serca nie została znacząco zmieniona przez leczenie. Średni przekrój poprzeczny włókna mięśniowego gastrocnemiusa był większy u myszy leczonych AAV9-GDF11PRO-Fc (+23%; p = 0,0226) i Aav9-GDF11PRO-Fc D122a (+ 25%; P = 0,0170; Fig. 5c I d). W analizie rozkładu MFD, MFD ma tendencję do osiągania maksimum około 20-30 µm we wszystkich grupach, co jest prawdopodobnie spowodowane wyższym odsetkiem małych regenerujących się włókien mięśniowych w mięśniach dystroficznych. Jednakże leczenie AAV9-GDF11PRO-Fc i AAV9-GDF11PRO-Fc D122A powodowało zwiększenie odsetka włókien mięśniowych o współczynnikach MFD wyższych niż 64 µm, co sugeruje, że ekspresja czynnika wywołała przerost włókien mięśniowych (Fig. 5e) w mięśniach szkieletowych.

analiza Western blot potwierdziła ekspresję białek transgenów w wątrobie i surowicy. Zgodnie z oczekiwaniami, pasmo przy 58 kDa odpowiadające pełnowymiarowemu GDF11PRO-Fc lub GDF11PRO-Fc D122a było wykrywalne u leczonych myszy. Stężenia propeptydu pełnej długości w surowicy były nieco wyższe u myszy leczonych D122A AAV9-GDF11PRO-Fc niż u myszy leczonych AAV9-GDF11PRO-Fc, co sugeruje, że utrzymywanie się aktywnego propeptydu w surowicy było zwiększone przez mutację D122A (Fig . 5f).

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują na ogólnoustrojową ekspresję GDF11PRO-Fc i GDF11PRO-Fc d122a zwiększa masę mięśni szkieletowych u dystroficznych myszy mdx i że ten przerost mięśni szkieletowych jest związany z poprawą siły chwytu i koordynacji ruchowej. Jednak leczenie nie wydaje się wpływać na wytrzymałość mięśni w oparciu o wydajność bieżni. Dodatkowo mutant d122a okazał się nieco bardziej skuteczny w zwiększaniu masy mięśniowej i funkcji, prawdopodobnie ze względu na lepszą trwałość surowicy.

systemowe dostarczanie genu GDF11PRO-Fc nie zmniejsza dystroficznej patologii u myszy mdx

wiele badań wykazało, że blokada sygnalizacji TGF-β-ActRII-SMAD2/3, czy to poprzez hamowanie mstn, czy blokadę ActRII, może przynieść korzyści terapeutyczne w zwierzęcych modelach DMD . W celu określenia wpływu leczenia AAV9-GDF11PRO-Fc na patologię dystroficzną wykonaliśmy analizę histologiczną mięśni kończyn i przepony.

charakterystyczne objawy patologii dystroficznej, w tym martwica mięśni, Centralne zarodkowanie, domięśniowe odkładanie kolagenu i obecność nacieków zapalnych były widoczne we wszystkich grupach mdx (Fig. 6a). U myszy leczonych AAV9 − GDF11PRO-Fc w badaniu gastrocnemius odsetek obszaru włóknistego zmniejszył się o-39% (p = 0,0273). Zwłóknienie w grupie gastrocnemius było również nieznacznie zmniejszone w grupie AAV9-GDF11PRO-Fc D122a; jednak ze względu na dużą zmienność osobniczą zwłóknienia mięśni kończyn domięśniowych, różnica ta nie osiągnęła istotności statystycznej (−28%; P = 0,1230; Fig. 6b). Nie zaobserwowano również znaczącej różnicy w proporcji centralnie zarodkowanych włókien mięśniowych, co sugeruje, że regeneracja włókien mięśniowych aktywnie występowała we wszystkich grupach (Fig. 6c). CK w surowicy, marker rozpadu mięśni, również nie został znacząco zmieniony przez leczenie (ryc. 6d). Ponadto, miejscowe pogorszenie integralności błon włóknistych, mierzone za pomocą immunofluorescencji IgG anty-myszy, było widoczne we wszystkich grupach mdx. Nieoczekiwanie myszy mdx leczone AAV9-GDF11PRO-Fc D122a wykazywały niewielki wzrost obszaru dodatniego IgG, ale ta różnica nie osiągnęła istotności statystycznej (+55%; P = 0,1729; Fig. 6e i f; dodatkowy plik 1: Rysunek S5). Oczywiste oznaki martwicy mięśni, regeneracji, centralnego zarodkowania i penetracji IgG nie były widoczne w dzikim typie C57BL / 10J gastrocnemius, co wskazuje, że markery te są specyficzne dla patologii dystroficznej (Fig. 6a-f; dodatkowy plik 1: Rysunek S5).

w przeponie, barwienie H & e wykazało rozległą martwicę i domięśniowe odkładanie kolagenu zarówno w leczonych, jak i nieleczonych grupach mdx (Fig. 6g). Podobnie jak w mięśniu gastrocnemius, leczenie AAV9-GDF11PRO-Fc lub AAV9-GDF11PRO-Fc D122a powodowało łagodne zmniejszenie ogólnego zwłóknienia przepony domięśniowej. Średni odsetek powierzchni włóknistej w przeponie zmniejszył się o 15% (p = 0,0328) i 17% (p = 0.019) odpowiednio z aav9-GDF11PRO-Fc i Aav9-GDF11PRO-Fc D122a (rys. 6h). Zgodnie z oczekiwaniami, te cechy patologiczne były w dużej mierze nieobecne w membranie myszy C57BL / 10J typu dzikiego (Fig. 6g I h). Na podstawie tych danych ustalamy, że GDF11PRO-Fc i GDF11PRO-Fc D122a są w stanie łagodnie hamować domięśniowe odkładanie się kolagenu w mięśniach kończyn i przeponie w okresie 3 miesięcy. Jednak leczenie nie wydaje się zatrzymywać trwającego cyklu degeneracji i regeneracji mięśni w gastrocnemius lub przeponie dorosłych myszy mdx.