Single beam scanning spectrofotometer

Er zijn twee belangrijke klassen van apparaten: single beam en double beam. Een spectrofotometer met dubbele bundel vergelijkt de lichtintensiteit tussen twee lichtbanen, waarbij één baan een referentiemonster bevat en de andere het testmonster. Een spectrofotometer met één bundel meet de relatieve lichtintensiteit van de bundel vóór en na het plaatsen van een testmonster. Hoewel vergelijkingsmetingen van dubbelbundel-instrumenten eenvoudiger en stabieler zijn, kunnen enkelbundel-instrumenten een groter dynamisch bereik hebben en optisch eenvoudiger en compacter zijn. Daarnaast zijn sommige gespecialiseerde instrumenten, zoals spectrofotometers gebouwd op microscopen of telescopen, single-beam instrumenten toe te schrijven aan bruikbaarheid.

historisch gezien gebruiken spectrofotometers een monochromator met een diffractierooster om het analytische spectrum te produceren. Het rooster kan beweegbaar of vast zijn. Als een enkele detector, zoals een fotomultiplicatorbuis of fotodiode wordt gebruikt, kan het rooster stapsgewijs worden gescand (scanning spectrofotometer) zodat de detector de lichtintensiteit bij elke golflengte kan meten (die overeenkomt met elke “stap”). Arrays van detectoren (array spectrofotometer), zoals charge coupled devices (CCD) of fotodiode arrays (PDA) kunnen ook worden gebruikt. In dergelijke systemen, wordt het rooster bevestigd en de intensiteit van elke golflengte van licht wordt gemeten door een verschillende detector in de serie. Bovendien gebruiken de meeste moderne midden-infrarode spectrofotometers een fouriertransformatietechniek om de spectrale informatie te verkrijgen. Deze techniek wordt Fourier transform infrarood spectroscopie genoemd.

bij het uitvoeren van transmissiemetingen vergelijkt de spectrofotometer kwantitatief de fractie van het licht die door een referentieoplossing en een testoplossing gaat, vergelijkt hij vervolgens elektronisch de intensiteit van de twee signalen en berekent hij het transmissiepercentage van het monster ten opzichte van de referentiestandaard. Voor reflectiemetingen vergelijkt de spectrofotometer kwantitatief de lichtfractie die uit de referentie-en testmonsters weerkaatst. Licht van de bronlamp wordt doorgegeven door een monochromator, die het licht diffracteert in een” regenboog ” van golflengten door middel van een roterend prisma en output smalle bandbreedtes van dit diffracte spectrum door middel van een mechanische spleet aan de uitvoerzijde van de monochromator. Deze bandbreedtes worden door het testmonster verzonden. Vervolgens wordt de fotonfluxdichtheid (watt per vierkante meter gewoonlijk) van het uitgezonden of gereflecteerde licht gemeten met een fotodiode, charge coupled device of een andere lichtsensor. De lichtdoorlatings-of reflectiewaarde voor elke golflengte van het testmonster wordt vervolgens vergeleken met de lichtdoorlatings-of reflectiewaarden van het referentiemonster. De meeste instrumenten zullen een logaritmische functie toepassen op de lineaire lichtdoorlatingsverhouding om de ‘absorptievermogen’ van het monster te berekenen, een waarde die evenredig is met de ‘concentratie’ van de gemeten stof.

kortom, de opeenvolging van gebeurtenissen in een scanningsspectrofotometer is als volgt:

1. De lichtbron wordt tot een monochromator geschenen, tot een regenboog gedistribueerd en in twee bundels gesplitst. Het wordt dan gescand door de steekproef en de verwijzingsoplossingen.
2. fracties van de invallende golflengten worden door het monster en de referentie verzonden of gereflecteerd.
3. het resulterende licht treft het fotodetectorapparaat, dat de relatieve intensiteit van de twee bundels vergelijkt.
4. elektronische circuits zetten de relatieve stromen om in lineaire transmissiepercentages en/of absorptiewaarden/concentratiewaarden.

in een array spectrofotometer is de volgorde als volgt:

1. De lichtbron scheen in de steekproef en gericht in een spleet
2. Het doorgelaten licht wordt gebroken in een regenboog met de reflection grating
3. De resulterende licht slaat de fotodetector apparaat dat vergelijkt de intensiteit van de bundel
4. Elektronische schakelingen zetten de relatieve stromingen in lineaire overdracht van percentages en/of absorptie/concentratie waarden

Veel oudere spectrofotometers moet worden gekalibreerd door middel van een procedure die bekend staat als “nul”, om de balans van de null huidige output van de twee balken op de detector. De overdracht van een referentiestof wordt vastgesteld als basiswaarde (datum), zodat de overdracht van alle andere stoffen wordt geregistreerd ten opzichte van de oorspronkelijke “nulwaarde”. De spectrofotometer zet vervolgens de overbrengingsverhouding om in “absorptievermogen”, de concentratie van specifieke bestanddelen van het testmonster ten opzichte van de oorspronkelijke stof.

toepassingen in de biochemiedit

spectrofotometrie is een belangrijke techniek die wordt gebruikt in vele biochemische experimenten waarbij DNA, RNA en eiwitisolatie, enzymkinetiek en biochemische analyses betrokken zijn. Aangezien de steekproeven in deze toepassingen niet gemakkelijk in grote hoeveelheden beschikbaar zijn, zijn zij vooral geschikt om in deze niet destructieve techniek te worden geanalyseerd. Bovendien kan kostbare Monster worden opgeslagen door gebruik te maken van een micro-volume platform waar slechts 1uL monster nodig is voor volledige analyses. Een korte uitleg van de procedure van spectrofotometrie omvat het vergelijken van de absorptie van een lege steekproef die geen gekleurde samenstelling aan een steekproef bevat die een gekleurde samenstelling bevat. Deze kleuring kan worden bereikt door een kleurstof zoals Coomasie briljante blauwe g-250 kleurstof gemeten bij 595 nm of door een enzymatische reactie Zoals Gezien tussen β-galactosidase en ONPG (verandert Monster geel) gemeten bij 420 nm.: 21-119 de spectrofotometer wordt gebruikt om gekleurde verbindingen in het zichtbare gebied van licht (tussen 350 nm en 800 nm) te meten,:65 Zo kan hij worden gebruikt om meer informatie over de stof te vinden die wordt bestudeerd. In biochemische experimenten wordt gekozen voor een chemische en/of fysische eigenschap en de procedure die wordt gebruikt is specifiek voor die eigenschap om meer informatie over het monster af te leiden, zoals de hoeveelheid, zuiverheid, enzymactiviteit, enz. De spectrofotometrie kan voor een aantal technieken zoals het bepalen van optimale golflengteabsorptie van steekproeven worden gebruikt, het bepalen van optimale pH voor absorptie van steekproeven, het bepalen van concentraties van onbekende steekproeven, en het bepalen van pKa van diverse steekproeven.:21-119 de spectrofotometrie is ook een nuttig proces voor eiwitreiniging en kan ook als methode worden gebruikt om optische analyses van een samenstelling tot stand te brengen. Spectrofotometrische gegevens kunnen ook worden gebruikt in combinatie met de Beer-Lambert Vergelijking, A = − log 10 T T = ϵ c l = O D {\textstyle A=-\log _{10}T=\Epsilon cl=OD}

, om verschillende relaties tussen transmissie en concentratie, en absorptie en concentratie.:21-119 omdat een spectrofotometer de golflengte van een verbinding door zijn kleur meet, kan een kleurstofbindende stof worden toegevoegd zodat deze een kleurverandering kan ondergaan en kan worden gemeten. Het is mogelijk om de concentraties van een mengsel van twee componenten te kennen aan de hand van de absorptiespectra van de standaardoplossingen van elk bestanddeel. Om dit te doen, is het noodzakelijk om de extinctiecoëfficiënt van dit mengsel op twee golflengtes en de extinctiecoëfficiënten van oplossingen die de bekende gewichten van de twee componenten bevatten kennen. Spectrofotometers zijn ontwikkeld en verbeterd over decennia en zijn wijd gebruikt onder chemici. Bovendien zijn spectrofotometers gespecialiseerd om de absorptiewaarden van de UV-of zichtbare lichtgolflengte te meten.: 21-119 het wordt beschouwd als een zeer nauwkeurig instrument dat ook zeer gevoelig en dus uiterst nauwkeurig is, vooral bij het bepalen van kleurverandering. Deze methode is ook handig voor gebruik in laboratoriumexperimenten omdat het een goedkoop en relatief eenvoudig proces is.