de mobiele fase

de mobiele fase in reversed-phase chromatografie is een mengsel van water of buffer met een polair organisch oplosmiddel zoals methanol, acetonitril, isopropanol (IPA) of tetrahydrofuran (THF). De elutiesterkte neemt ruwweg in deze volgorde toe. De alcoholen zijn proton donors terwijl acetonitril een proton acceptor is. Acetonitril / watermengsels hebben een lagere viscositeit dan mengsels van de andere oplosmiddelen met water. Dit resulteert in een lagere tegendruk. IPA / watermengsels hebben de hoogste viscositeit. Vanwege de lagere tegendruk die het gevolg is van de lagere viscositeit, zijn de twee meer algemeen gebruikte organische mobiele-fase modifiers acetonitril en methanol. Ook acetonitril heeft een lage absorptie in de lage UV, veel minder dan de andere oplosmiddelen.

Water is het zwakste eluent in reversed-phase chromatografie. De toevoeging van methanol of acetonitril vermindert de retentie. De logaritme van de retentiefactor neemt ongeveer evenredig af met de concentratie van het organische oplosmiddel. Als analyte een kleine molecule is zoals het geval is voor de meeste geneesmiddelen, zal het behoud ruwweg zevenvoudig afnemen wanneer de concentratie van methanol in de mobiele fase met ongeveer 20% toeneemt. In veel omstandigheden (bijvoorbeeld in methodeontwikkeling) wordt aangenomen dat er een lineair verband is tussen de logaritme van de retentiefactor en de volumefractie van de organische modifier in de mobiele fase. Dit is echter slechts een goede vuistregel, die noch juist, noch theoretisch gerechtvaardigd is.

vanwege de oplossingseigenschappen van acetonitril in vergelijking met methanol leidt de vervanging van het ene oplosmiddel door het andere vaak tot een verandering in de elutievolgorde van de analyten (Figuur 2). Daarom wordt deze techniek vaak gebruikt in methodeontwikkeling. De verandering van de ene modifier naar de andere creëert meer significante selectiviteitsveranderingen dan de verandering van de oplosmiddelsterkte alleen (d.w.z., door simpelweg de concentratie van het organische oplosmiddel te veranderen). THF verandert ook de selectiviteit drastisch. In feite worden de grootste selectiviteitsveranderingen vaak veroorzaakt door het vervangen van methanol of acetonitril door THF. Om verschillende redenen, zoals de onaangename geur, de vorming van peroxiden en ongunstige UV-transparantie, wordt het echter niet vaak gebruikt.

Figuur 2. Invloed van de mobile-phase modifier op de selectiviteit van de scheiding. Boven, acetonitril; onder, methanol. Kolom: XTerra RP18, 4,6 mm×50 mm, 3,5 µm. Gradiënt bij 2 ml min-1 over 15 min van 0 tot 80% organisch bij pH 3 met ammoniumformiaat. Analyten: 1, triamtereen; 2, chloortalidon; 3, althiazide; 4, furosemide; 5, benzthiazide; 6, probenecide; 7, ethacrynzuur; 8, bumetanide; 9, canrenzuur. (Chromatogram geleverd door Diane Diehl en Kim Tran, Waters Corporation.)

De interpretatie van de selectiviteit van oplosmiddelen wordt bemoeilijkt door het feit dat het organische oplosmiddel wordt geadsorbeerd door de stationaire liganden en kan worden beschouwd als onderdeel van de stationaire fase. Onlangs hebben verschillende auteurs de oppervlakte-overmaat van de organische modifiers voor standaard stationaire fasen van het C18-type gemeten en significante verschillen gevonden in de oppervlaktesolvatie tussen acetonitril en methanol.

aan het begin van deze rubriek werd vermeld dat methanol een hogere retentie biedt dan acetonitril. Dit is zelfs meer uitgesproken voor geïoniseerde samenstellingen dan voor niet-geïoniseerde samenstellingen. Dit is zinvol vanuit het standpunt dat geadsorbeerde methanol in de stationaire fase de penetratie van de geïoniseerde molecules in de stationaire fase vergemakkelijkt. Hetzelfde patroon wordt gevonden wanneer methanol wordt vergeleken met THF. Dit zijn handige functies in methode ontwikkeling. Anderzijds, tonen de samenstellingen met sulfonamide functionele groepen vrij meer behoud in THF, wanneer vergeleken met een groep referentieanalyten. In het algemeen kan een significante invloed van het organische oplosmiddel op de selectiviteit van een scheiding worden waargenomen, maar een rationalisatie is moeilijk, aangezien het oplosmiddel zowel in de stationaire als in de mobiele fase kan worden gevonden. Sommige auteurs hebben ook geprobeerd om mobiele fasen met een hoog watergehalte te onderscheiden van fasen met een laag watergehalte.

zoals hierboven vermeld, zijn de belangrijke selectiviteitsverschillen tussen de verschillende oplosmiddelen een zeer nuttig instrument bij de ontwikkeling van reversed-phase scheidingen. De klassieke methode ontwikkelingsschema ‘ s hebben methanol, acetonitril, en THF als organische modifiers in de mobiele fase gebruikt. Tussenliggende selectiviteiten kunnen worden verkregen met oplosmiddelmengsels, en een aanpassing van de piekafstand kan zonder moeite worden bereikt. Moderne methode ontwikkeling schema ‘ s gebruiken temperatuur als een andere gemakkelijk controleerbare variabele in de aanpassing van selectiviteit.

een belangrijk aspect van de selectiviteit van de mobiele fase is de pH. de controle van de retentie van ioniseerbare verbindingen met behulp van buffers of zuur-of base-additieven in de mobiele fase is zeer belangrijk. Door oordeelkundig de pH van de mobiele fase te kiezen, kan men de manipulatie van behoud en selectiviteit vergemakkelijken. Zoals hierboven vermeld, kan het verschil in behoud tussen de geïoniseerde en de niet – geïoniseerde vorm van een analyte 10 tot 30 vouwen zijn, en pH-controle is belangrijk.

in de afgelopen jaren heeft onderzoek aangetoond dat zowel de pH als de ionisatieconstanten van de buffer worden gewijzigd wanneer er organische oplosmiddelen aan worden toegevoegd. Dit heeft belangrijke gevolgen voor de controle op retentie. Men kan gewoonlijk tot een bepaalde ionisatie van analyte komen als pH van de mobiele fase ±2 pH-eenheden vanaf pKa van analyte is. Maar als de pH en de analyte pKa beide veranderen met de toevoeging van organisch oplosmiddel, dit is niet gemakkelijk om te gaan met behulp van eenvoudige regels. Daarom zijn een goede pH-regeling en een goede buffer belangrijke elementen van de reproduceerbaarheid van een reversed-phase scheiding van ioniseerbare analyten. De pH wordt gemeten in water, waar men bekend is met de pKa-waarden van de veelgebruikte buffers, en men verkiest dicht bij deze PKA-waarden te blijven. De maximale buffercapaciteit wordt gevonden bij de pKa van de buffer. Terwijl de pH verandert in de aanwezigheid van het organische oplosmiddel, de buffercapaciteit niet. Voor de beoefenaar van reversed-phase chromatografie, is dit een belangrijk aspect van behoudcontrole. Aan de andere kant, moet de onderzoeker van reversed-phase retentiemechanismen worden voorbereid om de pH in aanwezigheid van het organische oplosmiddel te meten om zijn invloed op retentie volledig te begrijpen. Typisch, resulteert de toevoeging van het organische oplosmiddel in een verhoging van de pKa van zuren, en in een daling van de pKa voor basen. Dit geldt voor zowel de buffers als de analyten. Dit kan resulteren in een significante verschuiving in het verwachte ionisatiepatroon van een analyte. Hier is een voorbeeld dat dit illustreert: een amine met een pKa van 9 wordt volledig geïoniseerd in een fosfaatbuffer bij pH 7 in water, maar het mag slechts half geïoniseerd worden in dezelfde buffer na toevoeging van 70% methanol. Het is duidelijk dat dergelijke effecten aanzienlijk zijn. Daarom is een nauwkeurige manier om een buffer voor te bereiden en zijn pH te controleren essentieel voor een goede controle van de reversed-phase retentie van ioniseerbare analyten.

andere Ionische interacties beïnvloeden ook de retentie en selectiviteit van een reversed-phase scheiding van geïoniseerde analyten. Een klassiek hulpmiddel om het behoud van ionische analytes te verhogen is ionenpaarchromatografie. In deze techniek, wordt de stationaire fase equilibrated met een hydrophobic geladen ion, zoals een lang-keten sulfonzuurion (b.v., octylsulfonate) of een hydrophobic quaternary amine (B. V., het tetrabutylammoniumion). Een typische mobiel-faseconcentratie is rond 10 mM. de toevoeging van het ion-paarreagens aan de mobiele fase verhoogt het behoud van doelionen, vermindert het behoud van ionen van dezelfde Last als het ion-paarreagens, en laat het behoud van neutrale analyten met inbegrip van zwitterions bijna onaangetast. Het is dus een uitstekend hulpmiddel om de selectiviteit van een scheiding aan te passen. De reden voor deze veranderingen in de selectiviteit is het feit dat het ionenpaarreagens op de oppervlakte van de stationaire fase wordt geadsorbeerd. De eenvoudigste interpretatie van het resulterende retentiemechanisme is een combinatie van ionenuitwisseling met het reversed-phase mechanisme. Aangezien de concentratie van het ion-paarreagens in de mobiele fase toeneemt, stijgt het behoud van tegengesteld geladen analytes aanvankelijk, en dan niveaus weg bij hogere concentraties. Bij ionenpaarreagentia met verschillende ketenlengte neemt de retentie sneller toe bij een langere ketenlengte.

een ander ion-interactieeffect dat met kationische analyten wordt waargenomen, is de toename van retentie wanneer kleine anorganische teller-ionen aan de mobiele fase worden toegevoegd. De vereiste concentraties zijn doorgaans ongeveer 10 keer hoger dan de concentraties die met ionenpaarreagentia worden gebruikt. Typische anionen van dit type zijn perchloraat (ClO4−), tetrafluorboraat (BF4−) of hexafluorofosfaat (PF6−). Zij verhogen het behoud van kationische analyten beduidend. Het effect is meer uitgesproken bij acetonitril als additief in de mobiele fase dan bij methanol. Dit wordt verklaard door een dikkere laag acetonitril geadsorbeerd aan de stationaire fase in vergelijking met een monomoleculaire laag methanol, en de verdeling van het tegenion in deze laag. Vanuit het standpunt van de gebruikers, is het retentiegedrag van kationische analyten in de aanwezigheid van deze anorganische anionen niet verschillend aan die waargenomen met ware ionenpaarreagentia, d.w.z., met sulfonzuren met lange keten.