diagnose

klinische diagnose: klinisch beeld van de patiënten die lijden aan chlamydiale infectie kan misleidend zijn aangezien tot 70-80% van de geïnfecteerde vrouwen en 50% van de geïnfecteerde mannen asymptomatisch zijn. Typisch, een vrouw met ongecompliceerde chlamydiale infectie zal presenteren met geurloze, mucoïde vaginale afscheiding zonder pruritis. Dysurie zonder frequentie of urgentie zal worden geklaagd over als urethra is betrokken. Verder, in PID, kan de geschiedenis van strenge buikpijn met hoge koorts, dyspareunie, langdurige menstruele cycli en intermensturaal aftappen worden opgewekt. Bij onderzoek kan cervicitis met een gele, troebele, slijmvliesafscheiding vanuit de os worden gezien. De baarmoederhals heeft de neiging om gemakkelijk te bloeden wanneer geschraapt met spatel of borstel. Urineonderzoek zal de aanwezigheid van >5 WBC/HPF (high power field) aan het licht brengen, hetgeen wijst op urethritis13. Chlamydiale infecties kunnen klinisch niet worden onderscheiden van andere urethrale infecties. Amine test (d.w.z., significante geurafgifte na toevoeging van KOH aan de vaginale secretie) kan helpen chlamydiale infecties te onderscheiden van andere lagere genitale infecties, maar heeft een lage specificiteit.

chlamydiale infectie bij mannen manifesteert zich als urethritis bij 15-55 procent van de aangetaste personen die minder dan of gelijk zijn aan 35 jaar, soms kan epididymitis worden gezien2. Milde tot matige heldere tot witte urethrale afscheiding wordt gezien in de ochtend voordat de patiënt holtes. Bij epididymitis kan een voorgeschiedenis van unilaterale testiculaire pijn met scrotum erytheem, gevoeligheid of zwelling over de epididymis worden opgewekt. De diagnose kan worden vastgesteld door de aanwezigheid van mucopurulente afscheiding uit de penis die bij gramkleuring >5 WBC/HPF vertoont en afwezigheid van intracellulaire gramnegatieve diplokokken. Het syndroom van Reiter kan een zeldzame complicatie van onbehandelde chlamydiale infectie zijn. Een reactieve artritis die triade van urethritis/cervicitis bij vrouwen, conjunctivitis en pijnloze mucopurulente uitbarsting op handpalmen en voetzolen omvat wordt gezien in Reiter ‘ s syndrome29. Vrouwen worden vaker getroffen dan mannen. Er is asymmetrische meervoudige gewrichtsverbeteringen met voorliefde voor onderste ledematen.

laboratoriumdiagnose: asymptomatische aard van de ziekte en het toenemende spectrum van infecties veroorzaakt door C. trachomatis benadrukken de noodzaak van de gevoelige en betrouwbare laboratoriummethoden.

vaardigheid in het verzamelen en vervoeren van monsters is van het grootste belang voor nauwkeurigheid bij diagnostische tests. Zowel de gevoeligheid als de specificiteit van diagnostische tests voor C. trachomatis zijn aangetoond om direct verband houden met de geschiktheid van het specimen. De gastheercellen die het organisme bevatten, moeten in de monsterverzameling worden opgenomen aangezien chlamydiae verplichte intracellulaire pathogenen zijn, vooral in technieken die directe visualisatie van het organisme impliceren.

de keuze van de bemonsteringsplaatsen kan van invloed zijn op de kans op herstel van het pathogeen. Een 10-20 procent toename van het herstel van C. trachomatis uit de geslachtsorganen is waargenomen als zowel cervicale en urethrale monsters worden genomen in vergelijking met cervicale bemonstering alleen42. Endocervicaal uitstrijkje, vaginaal / introitaal uitstrijkje, vulval uitstrijkje evenals urethrale en rectale uitstrijkje en eerste vangst urine zijn de gemeenschappelijke monsters genomen van de vrouwelijke patiënten. Urethrale en rectale uitstrijkje en eerste vangst urine monster kan ook worden verzameld van mannelijke patiënten in aanvulling op andere specifieke monsters zoals prostaatvloeistof.

kwaliteitsborging van de verzameling en het transport van het monster: de geschiktheid van het monster kan worden bepaald door visualisatie van squamo-zuilvormige cellen tijdens de microscopie. Een specimen wordt als adequaat beschouwd als het één zuilvormige/metaplastische cel per dia bevat. De kans op isolatie wordt geoptimaliseerd als het monster onmiddellijk na het verzamelen bij 2-8°C wordt gekoeld.de tijd tussen het verzamelen van het monster en de verwerking moet idealiter minder dan 48 uur bedragen, als dat niet mogelijk is, mogen deze tot de verwerking bij -70 °C worden ingevroren16. Foetaal runderserum (2-5%) helpt de levensvatbaarheid van chlamydiae in het te invriezen monster te behouden. Twee-molair sucrose fosfaat (2-MSP) of sucrose glutamaat fosfaat zijn de meest gebruikte transportmedium. Synthetische transportmedia voor kweek en een aantal tests buiten kweek zijn ontwikkeld en goedgekeurd voor diagnostisch gebruik, zoals M4 transportmedium, Flex Trans medium en nieuw M4 synthetisch/universeel medium.

de laboratoriumdiagnose van Chlamydia bestaat uit de volgende methoden:

(i) specifieke tests

celcultuur: isolatie van het organisme is de definitieve methode voor de diagnose van chlamydiale infectie. Chlamydia is een verplicht intracellulair pathogeen en vereist daarom geëmbryoneerde kippenei of dierlijke cellijnen voor cultuur. Dergelijke kweekmethoden zijn technisch moeilijk, arbeidsintensief, omslachtig en duur en worden niet algemeen gebruikt als routinetest in algemene klinische laboratoria. Echter, drie in vitro systemen zijn gebruikt voor cultuur van chlamydiae viz. muizeninoculatie (intraperitoneaal, intracraniaal en intraveneus), dooierzakinoculatie (7-8 dagen oude kippenembryo dooierzakinoculatie) en celcultuurlijnen16. De meest gebruikte cellijnen omvatten – HeLa 229 cellen, McCoy cellen, BHK21 en bgmk cells24.

de gevoeligheid van celkweek voor isolatie van chlamydiae wordt versterkt door de voorbehandeling van de cel met polycaties, DEAE-dextranen, centrifugering van het entmateriaal op de celmonolaag en incorporatie van antimetabolieten zoals cycloheximide of cytochalasine B in het celkweekmedium 42. Cel monolaag voor cultuur van C. trachomatis wordt geteeld in trommel of shell flesjes op glazen coverslips of in de putten van multiwell celcultuur gerechten. De schaalflesmethode is gevoeliger voor klinische specimen dan multiwell celkweek toe te schrijven aan minder kansen van kruisbesmetting42. Voorafgaand aan inoculatie moet het specimen worden gesoniceerd om de gastheercellen te verstoren en chlamydiale insluitsels te scheiden. Om de celculturen in te enten, moet het bovenliggende kweekmedium worden verwijderd en vervangen door voldoende specimen in het kweek transportmedium om de monolaag te bedekken en drogen te voorkomen.

het meest gebruikte groeimedium is Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) aangevuld met aminozuren en vitamines, foetaal kalfserum (5-10), extra glucose (0,056 m) en 2-glutamine42. Na inoculatie worden de culturen 2-3 dagen bij 37o C geïncubeerd. De chlamydiale insluitsels worden dan waargenomen door immunofluorescente kleuring. De gevoeligheid van de isolatie is aangetoond te variëren van 70-85 procent, afhankelijk van het laboratorium en het gebruikte kweeksysteem. Traditioneel is dit de” gouden standaard ” voor de diagnose van C. trachomatis aangezien het 100 procent specifiek42 is. Helaas, het is buiten de mogelijkheden van de meeste particuliere en openbare laboratoria als gevolg van de technische vraag, arbeidsintensiteit en hoge kosten.

directe fluorescentietest (Dfa): De DFA-test voegt het aanzienlijke voordeel van Chlamydia – specifieke antilichaamkleuring toe aan direct onderzoek van specimen en blijft een van de nuttigste diagnostische technieken. In deze test wordt snelle identificatie van elementaire lichamen in uitstrijkjes met flouresceïne – isothiocynaat-geconjugeerde monoklonale antilichamen (FITC-Mab) tegen MOMP of genus-specifieke LPS gebruikt. Elementaire lichamen verschijnen als verschillende, scherp omlijnde, appelgroene, schijfvormige (300 nm) deeltjes en netvormige lichamen verschijnen ongeveer drie keer groter dan elementaire lichamen met een fluorescerende halo.

deze procedure vereist geen strikte voorwaarden voor het vervoer van monsters, aangezien een uitstrijkje aan de zijkant van het bed wordt bereid en vervolgens voor verwerking wordt vervoerd. Met het gebruik van MOMP van C. trachomatis wordt de gevoeligheid en specificiteit van DFA gevonden om 80-90 percent en 98-99 percent, respectievelijk met betrekking tot cultuur43 te zijn. De hoge specificiteit van DFA wordt toegeschreven aan zijn afhankelijkheid van de visualisatie van onderscheidende morfologie en kleuring kenmerken van chlamydiale insluitsels. DFA is de enige beschikbare diagnostische test die gelijktijdige beoordeling van specimentoereikendheid door visualisatie van epitheliale cellen huidig in het uitstrijkje toelaat. Het is snel en eenvoudig (doorlooptijd ongeveer 30 min) maar microscopisch onderzoek en interpretatie van de resultaten vereist expertise. Deze methode wordt daarom aanbevolen voor laboratoria met een laag volume. Deze test kan ook worden toegepast op extragenitale sites. Er wordt gemeld dat het gevoeliger is dan cultuur voor de detectie van Chlamydia in endometrium of tubale specimen42.

ELISA (enzyme linked immunosorbant assay): ELISA is beschikbaar voor de detectie van C. trachomatis antigeen. Hiervoor zijn verschillende in de handel verkrijgbare ELISA kits beschikbaar. De meeste van deze detecteren chlamydial LPS die oplosbaarder is dan MOMP. De enzyme immunoassay (EIA) testen hebben een gevoeligheid van 62-96 procent en een specificiteit van 86-99 procent in vergelijking met celcultuur44. Deze test is geschikt voor laboratoria zonder toegang tot celcultuur. Verschillende grote en kleine studies over de hele wereld,waaronder India,hebben echter een slechte gevoeligheid van ELISA gemeld in vergelijking met DFA en PCR45, 46, 47.

cytologie: cytologie is een gemakkelijk beschikbare, eenvoudig te gebruiken en kosteneffectieve diagnostische test. Het vereist geen voorzorgsmaatregelen voor de opslag en het vervoer van de monsters, en niet-levensvatbare/niet-infectieuze deeltjes kunnen ook worden gedetecteerd. De kwaliteit van het klinische specimen kan door de microscopische techniek worden beoordeeld en de in deze tests gebruikte technische procedures zijn gewoonlijk sneller en eenvoudiger uit te voeren dan cultuur. Giemsa, immunoflourescentie en jodiumkleuringmethoden worden het meest gebruikt. Andere vlekken zoals immunoperoxidase, immunoferritine, May Grunwald, Giemenez, Macchiavello en acridine orange kunnen ook worden gebruikt voor het opsporen van chlamydiale opname in geëxfolieerde cellen. De aanwezigheid van intracytoplasmatische insluitsels is pathogonomisch voor chlamydiale oculaire infecties bij pasgeborenen, deze methode wordt echter niet aanbevolen voor het diagnosticeren van conjunctivitis of genitale infectie bij volwassenen vanwege het gebrek aan gevoeligheid. Van de drie methoden biedt immunofluorescentie de hoogste gevoeligheid gevolgd door Giemsa en vervolgens jodiumkleuring42.

moleculaire methoden: De traditionele methodes van diagnose hebben verscheidene beperkingen die lage gevoeligheid, lange het testen tijd en hoge kosten omvatten. Daarom worden de tests die op de directe erkenning van de opeenvolgingen van DNA en RNA worden gebaseerd bedacht. De in de handel verkrijgbare DNA-sonde voor de detectie van Chlamydia is de PACE 2-test (Probe Assay Chemiluminescence Enhanced)48, die ook Neisseria gonorrhoeae kan detecteren, een niet-isotopische DNA-sonde voor de detectie van specifieke delen van r-RNA van C. trachomatis in het endocervicale en urethrale Monster. Een andere sonde van DNA, de test van PACE 2C is ook ontwikkeld die gelijktijdig zowel C. trachomatis als N. gonorrhoeae van één enkel specimen detecteert; nochtans, is verdere evaluatie van PACE 2C vereist alvorens het in diagnostiek wordt gebruikt. Deze tests gebruiken een chemiluminescente sonde van DNA die aan een species – specifieke opeenvolging van chlamydial 16S rRNA kruist. Zodra de DNA-rRNA hybride wordt gevormd, wordt het geadsorbeerd op een magnetische parel en de chemiluminescente reactie wordt kwantitatief gedetecteerd met een luminometer. Aangezien actief delende chlamydiae tot 104 kopieën van 16S rRNA bevatten, zou de PACE 2-test theoretisch gevoeliger moeten zijn dan antigeendetectiesystemen. De gevoeligheid van PACE 2 ten opzichte van een DNA-amplificatiestandaard is nog niet goed geëvalueerd, maar werd in één studie gerapporteerd als 77 tot 93 procent48.

de ontwikkeling van tests op basis van neic acid amplification technology (NAAT) is de belangrijkste vooruitgang op het gebied van chlamydiale diagnose sinds in vitro celcultuurtechnieken de dooierzak vervangen voor kweek en isolatie van het organisme uit klinische specimens. NAAT is minstens 20-30 procent gevoeliger (in staat om zo weinig als een enkele gen kopie te detecteren) en 100 procent specifiek49,50. Het biedt de mogelijkheid om niet-invasieve steekproeven zoals urine te gebruiken om besmettingen in asymptomatische individuen te screenen die gewoonlijk geen klinische zorg zouden zoeken. Dit is een cruciaal voordeel, omdat de meerderheid van chlamydiale infecties bij vrouwen en een significant deel van infecties bij mannen asymptomatisch zijn. Het wijdst bekende van de de versterkingstechnologieën van DNA is PCR. PCR kan geslacht, species, groep, of Stam specifiek zijn afhankelijk van het inleidingsontwerp. Genen gericht voor diagnose van C. trachomatis zijn het MOMP-gen, het endogene plasmide, het fosfolipase-gen en het 16S en 23S rRNA-gen. Aangezien alle nucleic acid amplification technologies nucleïnezuur targets detecteren, zijn deze niet afhankelijk van de levensvatbaarheid of een intacte staat van het doelorganisme voor een positief resultaat. Daarom is het vervoer van de steekproef niet van cruciaal belang49. Hoewel het niet goed is bestudeerd, lijkt het” venster ” voor de cultuurnegatieve, PCR-positieve toestand na behandeling met doxycycline tot 3 wk29 te duren. Na deze tijd, worden de geduldige specimens zowel cultuur als PCR negatief.

de PCR-test voor de detectie van C. trachomatis ontwikkeld door Roche Diagnostics, Bazel Zwitserland (Roche-Amplicor) was de eerste PCR-test die door FDA in de Verenigde Staten51 moet worden goedgekeurd. Sinds 1993 is de PCR van Amplicor relatief goed geëvalueerd voor zowel urogenitale als urinemonsters, met een totale gevoeligheid en specificiteit van respectievelijk 90 en 99 tot 100 procent51. Amplicor PCR is goedgekeurd voor cervicale, mannelijke urethrale en mannelijke urine monsters.

met de explosie van moleculaire biologische technieken nieuwere analyses zoals het M2000-systeem (Abbott), evenals strand-displacement amplification (SDA) (Bd ProbeTec strand displacement amplification ontwikkeld door Becton Dickinson and Company, Diagnostic Systems, Franklin Lakes, N. J.) en transcriptie-mediated amplification (TMA) (APTIMA-systeem door Gen-Probe, Inc., San Diego) beschikbaar kwam voor C. trachomatis. Hoewel populair in de ontwikkelde landen, hun hoge initiële en onderhoudskosten te voorkomen dat het gebruik in resource-arme instellingen.

De last van C. trachomatis organismen in het genitale kanaal (chlamydiale belasting) kunnen worden gedetecteerd door kwantitatieve real-time PCR en kan variëren van 10 tot meer dan een miljoen organismen/ml van genitale tractus secreties52. Dit zal waarschijnlijk de prestaties van verschillende nucleïnezuuramplificatietests beïnvloeden, die geen routinematig onderscheid maken tussen mensen met hoge en lage chlamydiale belastingen. Verschillen in chlamydiale belasting zijn gemeld in verband te worden gebracht met de aanwezigheid van klinische symptomen, de overdraagbaarheid en persistentie van infectie, en het risico op het ontwikkelen van chronische sequelae53. Vandaar, is er een kritieke rol van kwantificering in de diagnose en de behandeling van chlamydial besmettingen.

De NAATs zijn de meest gevoelige tests voor de screening en diagnose van chlamydiale en gonokokkeninfecties van het genitale tract54,55,56. Er worden echter twijfels geuit over hun prestaties in gebieden met lage prevalentie57,58. In 2002 heeft de CDC aanbevolen om alle positieve NAATs voor C. trachomatis te bevestigen wanneer de positieve voorspellende waarde van de test <90% is59. De werkelijke specificiteit van Naat-methoden blijkt echter >99% te zijn54,55.

het CDC heeft ook verschillende mogelijke strategieën voor bevestiging59 voorgesteld, waaronder: I) het testen van een tweede monster met een andere NAAT met een gelijke of hogere gevoeligheid voor de eerste test, ii) het uitvoeren van een andere NAAT met een gelijke of hogere gevoeligheid voor de eerste test, gericht op een andere nucleïnezuursequentie op het oorspronkelijke monster, iii) het herhalen van de oorspronkelijke test op het oorspronkelijke monster, en iv) het terugbrengen van de patiënt voor een hertest.

de beschreven beperkingen zijn echter dat de meeste clinici niet twee monsters zullen verzamelen voor dezelfde evaluatie, noch is het haalbaar om de patiënt terug te brengen om een ander monster te verzamelen, en de meeste laboratoria niet over de faciliteiten / capaciteit beschikken om twee verschillende Naat ‘ s uit te voeren.

het concept van bevestigende tests is niet nieuw57. Echter; het bemoeilijkt de behandeling van een Naat positief monster en voegt kosten toe aan een toch al dure screeningtest. Ook is er nog ruimte voor het verbeteren van de gevoeligheid van NAATs, misschien door een betere preparaatvoorbereiding, automatisering of doelconcentratie.

(ii) niet-specifieke tests

Leukocytenesterase (LE) test is een snelle peilstok test voor gebruik met urinemonsters. Deze test is ontworpen om urineweginfecties te detecteren door het enzym te detecteren dat door de polymorfonucleaire (PMN) cellen wordt geproduceerd. Positieve le testresultaten komen voor bij infecties veroorzaakt door een aantal verschillende agentia, waaronder C. trachomatis en N. gonorrhoeae.

de gevoeligheid van de LE-test voor de detectie van C. trachomatis-infectie varieert sterk van 31 tot 100% en de specificiteit varieert van 83 tot 100% 60. De LE-test werd beschouwd als de beste screeningtest voor adolescente mannen en mag, volgens de meeste rapporten, niet worden gebruikt voor het testen van monsters van vrouwen of oudere mannen vanwege onbevredigende prestaties.

(iii) Rapid point of care (POC) tests

snelle tests, ook wel “point-of-care” tests voor C. trachomatis maken gebruik van EIA-technologie in formaten die voornamelijk gebaseerd zijn op membraanafvang of latex-immunodiffusie. Snelle tests worden uitgevoerd in de kantoren van de arts, vereisen geen geavanceerde apparatuur, en kan worden voltooid in ongeveer 30 minuten. Resultaten worden visueel gelezen en zijn dus kwalitatief. Hoewel verschillende kits in de handel verkrijgbaar zijn, maar geen is goed geëvalueerd. In het algemeen zijn de snelle tests aanzienlijk minder gevoelig en specifiek dan door laboratorium uitgevoerde EIAs. Vergeleken met PCR, de gevoeligheid en specificiteit van de Clearview-test (Unipath Ltd., UK) waren respectievelijk 53,8 en 99,1 procent met endocervicale uitstrijkjes, en 31,1 en 95,2 procent met vaginale uitstrijkjes van Filipijnse vrouwen61. De snelle tests bieden een voordeel ten opzichte van conventionele laboratoriumtests alleen wanneer de resultaten onmiddellijk nodig zijn voor de behandeling van de patiënt. Snelle tests mogen niet worden gebruikt bij een populatie met lage prevalentie of bij asymptomatische personen vanwege de mogelijkheid van vals-positieve resultaten. De resultaten van een snelle test moeten altijd als vermoedend worden beschouwd en, indien positief, door een door het laboratorium uitgevoerde test worden bevestigd.

kortom, hoewel cultuur 100% specifiek is, kan de geschatte gevoeligheid zo laag zijn als 50%. Het merendeel van de Laboratoria heeft zich vanwege de kosten, de tijd en de technische problemen van de cultuur afgekeerd. Dus, in plaats van cultuur als een diagnostische gouden standaard, de uitgebreide gouden standaard/gedefinieerde referentiestandaard, dat wil zeggen, algemeen consistent resultaat met twee niet-cultuur technieken wordt beschouwd als nuttig als onderzoeksinstrument te zijn43.

(iv) serologie

de serologische tests zijn over het algemeen niet nuttig bij de diagnose van genitale infecties veroorzaakt door C. trachomatis. Antilichamen opgewekt door C. trachomatis infectie zijn langlevend en een positieve antilichaamtest zal geen onderscheid maken tussen een vorige en een huidige infectie.