plantaardig materiaal

Opmerkingen en chemische analyses werden uitgevoerd in 2011 en 2018 op een verzameling van planten in de experimentele tuin aan de Universiteit van Louvain-la-Neuve campus (50°39’55″N, 4°37’11″E). Voor en tijdens hun bloeiperiode (juli–augustus) werden planten onder gecontroleerde omstandigheden in de groeikamers van de Universiteit geplaatst (24/22 °c; 16 L:8D, RH 80 ± 10%).

Insectenmateriaal

De belangrijkste insectenbezoeksoorten van A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum, en B. terrestris) werden gebruikt in proeven met de aantrekkelijkheid van bloemen en smaakvoorkeur. A. mellifera en B. pascuorum individuen (10 per test en behandeling) werden verzameld in het wild rond de campus van de universiteit (minimaal vier locaties per soort) in de ochtend voorafgaand aan de tests. Als B. terrestris individuen zijn niet gemakkelijk te onderscheiden in het veld (vergelijkbare morfologie voor verschillende soorten), We gebruikten hommels van vier bijenkorven (Biobest, Westerloo, België) geplaatst in de buurt van de universiteitsgebouwen om individuen te verkrijgen voor experimenten.

Bloemeigenschappen

Pollenaantal

de meeldraden van 10 bloemen in mannelijke en vrouwelijke fasen werden verzameld, geteld, gedroogd en op een zeef (90 µm) geplaatst om te worden gewreven om pollenkorrels te verzamelen. De hoeveelheid stuifmeelkorrels werd gewogen. Pollen tellingen werden uitgevoerd op Lille-1 Universiteit (Evo-Eco-Paleo eenheid). We gebruikten een deeltjesteller om het aantal stuifmeelkorrels in deze monsters te schatten. De dag voor pollen tellen, monsters werden geplaatst in een buis verwarming totdat het grootste deel van de ethanol verdampt. Vervolgens hebben we de helmonthiscentie gedwongen door monsters ‘ s nachts in een oven bij 56 °C te plaatsen. Aan elk stuifmeelmonster hebben we 1 mL gedestilleerd water toegevoegd. Buizen werden vervolgens gesoniceerd en vortexed om afzonderlijke stuifmeelkorrels van de helmknoppen en elkaar. Pollenoplossing (200 µL) werd vervolgens verdund in 5 mL isotone meetbuffer (CASY® ton). De deeltjesteller analyseerde drie monsters van 400 µL van de pollensuspensie, waarbij de totale deeltjesaantelling in dit volume van 1200 µL werd verkregen, evenals tellingen voor 400 grootteklassen variërend van 0,125 tot 150 µm. Vergelijkingen met blanco monsters stelden ons in staat om pieken van deeltjes te identificeren, met een grootte variërend van 20 tot 30 µm, wat overeenkomt met stuifmeelkorrels. Het aantal stuifmeelkorrels per helmstok werd geschat door de waarden van de deeltjesteller te vermenigvuldigen met de verdunningsverhouding (d.w.z. (1000/200) × (5000 + 200)/1200).

bloemkleur en morfologie

We hebben bloemeigenschappen (kroonlengte, kroondiameter, bloemkleur en UV-reflectie) gemeten op 10 bloemen per fase (van 10 verschillende individuen). Helmbreedte, corolla lengte en diameter werden gemeten met een remklauw. We hebben het tepal kleurreflectiespectrum gemeten met behulp van een glasvezel spectrometer (Avaspec-ULS2048) en een xenon-gepulste lichtbron (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Nederland). Voor metingen van de UV-reflectie werden bloemen op een zwarte achtergrond gefotografeerd met een Nikon D40 (Coastal Optical 60 mm 1:4 UV-VIS-ir ApoMacro; Filtre X-Nite 330).

vluchtige verzameling bloemen

we hebben vluchtige organische stoffen (Vos) uit intacte bloemen in de mannelijke en vrouwelijke fase bemonsterd (n = 4 voor elke fase). Elke bloem werd individueel geplaatst in een glazen bol (50 mm lang en 30 mm diameter), met een opening van 17 mm diameter. Om luchtvervuiling te voorkomen werd een met actieve houtskool gevulde teflon buis aan het ene uiteinde van de glazen bol aangesloten en twee glazen Tenax TA buizen (6 mm × 4 mm, 7 inches; 60-80 mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, België) aan het andere uiteinde. De Tenax buizen werden aangesloten op gekalibreerde luchtpompen (Gilair plus, Sensidyn, St. Petersburg, USA) met een debiet van 50 mL·min−1 gedurende 180 min (tussen 11:00 en 14:00 uur). De laboratoriumomstandigheden varieerden tussen 21,5 en 23,5 °C met 45 tot 55% RH.

gevangen vos werden vervolgens thermisch gedesorbeerd op een Agilent 6800 gaschromatograaf met een Gerstel TDU thermodesorptie-eenheid en CIS-cryokoeler op -50 °C. onmiddellijk na thermodesorptie werd de CIS−eenheid T° geprogrammeerd van -50 °C tot 300 °C bij 12 °C sec-1. Het GLC apparaat was gekoppeld aan een Agilent 7975 C massaspectrometer. De analytische omstandigheden waren als volgt: split-modus injectie (met split ratio van 50: 1, helium bij 1,6 mL min-1 als dragergas), VF-Max MS 30 m x 250 µm (df = 0,25 µm) kolom (Agilent). Het temperatuurprogramma voor de beste scheiding (voorafgaande tests niet aangetoond) werd als volgt vastgesteld: 40 °C (5 min) vervolgens tot 75 °c bij 4 °C min−1 en tot 115 °C (3 °C min−1) en ten slotte tot 250 °C bij 13 °C min−1. MS voorwaarden waren als volgt: EI-modus bij 70 eV, bron T ° = 250 °C, MS quadrupole bij 200 °C, en gescande massa bereik 35 tot 500 amu.

de geregistreerde chromatogrammen werden systematisch geïnterpreteerd om te zoeken naar vos specifiek voor mannelijke of vrouwelijke fasen. Wanneer gedetecteerd, werden de moleculen geà dentificeerd volgens berekende databases (Wiley 250.L en pal 600). De identificaties werden bevestigd op basis van de retentiegegevens van in de handel verkrijgbare zuivere moleculen. Ze werden ook gekwantificeerd ten opzichte van zeer zuivere interne standaard (limoneen, 1 µL methanoloplossing bij 0.67 µg µL1 automatisch toegevoegd aan elke desorptiebuis vóór het thermische proces).

omgevingslucht werd ook verzameld als een controle om achtergrondcontaminanten te identificeren. Om een mogelijke doorbraak te voorkomen, werd systematisch een tweede glazen patroon met hetzelfde adsorptiemiddel (Tenax TA) in tandem geplaatst. De analyse toonde geen sporen van de moleculen van belang.

Alkaloïdenverzameling en analyses

helmknoppen werden verzameld van 50 bloemen (van 10 individuen), gedroogd en vervolgens fijngemaakt op een zeef (90 µm) om stuifmeelkorrels te verzamelen. Drie replica ‘ s van 15 mg pollen werden bemonsterd voor alkaloïden. De monsters werden gedurende 2 uur ingevroren (-80 °C) en vervolgens gevriesdroogd. Droge monsters werden gemalen tot een fijn poeder met vloeibare stikstof en gewogen hoeveelheden poeder werden in een 1,5 mL microcentrifugebuis (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) geplaatst. Alkaloïden werden geëxtraheerd met een weefselhomogenisator (VWR Ultrasone Reiniger) gedurende 10 minuten in 100 µL extractiebuffer (70% waterige methanol en 0,5% mierenzuur). Na centrifugeren bij 12.000 toeren per minuut gedurende 5 minuten (Centrifuge 5430 R), werd het supernatant overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,5 mL. Na drogen in een SpeedVac werden alkaloïden geresuspendeerd in 200 µL LC-MS-grade methanol en gefilterd met een 0,45 µm PTFE spuitfilter (Whatman).

Nectar werd verzameld in glazen capillairbuizen van 5 µL (Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Duitsland) van 50 bloemen (van 10 individuen). Drie replica ‘ s van 15 µL nectar werden gedroogd in een SpeedVac en geresuspendeerd in 200 µL LC-MS-grade methanol vóór filtratie met een 0,45 µm PTFE spuitfilter (Whatman).

chemische analyses werden uitgevoerd met behulp van een LC-MS/MS systeem bestaande uit een Thermo Accela pomp, autosampler, fotodiode array detector, en een Thermo Scientific LTQ orbitrap XL massa detector (MASSMET, Leuven Drug Research Institute, Woluwe, België). Er werd een Phenomenex Gemini C18 kolom gebruikt (2 mm × 150 mm, verpakt met 3 µm deeltjes). Er werd een binair oplosmiddelsysteem met een debiet van 300 µL min−1 gebruikt: oplosmiddel a, HPLC-grade water (0,1% mierenzuur); en oplosmiddel B, LC-MS-grade methanol (0 min: 95% A, 10-12 min: 0% A, 13-17 min: 95% A). Er werd een volume van 10 µL geïnjecteerd en de kolomtemperatuur werd ingesteld op 30 °C. MS met hoge resolutie werd uitgevoerd met een elektrospray-ionisatiebron in positieve modus. De volgende inlaatcondities werden toegepast: capillaire temperatuur, 275 °C; capillaire spanning, 13 V; buislens, 140 V; schede gasstroom, 30 E.E.; en auxiliary gas flow, 10 E.data acquisitie en verwerking werden uitgevoerd met Xcalibur software. Deze methode bestreek het massabereik van alle alkaloïden (MW van 329 tot 673). Alkaloïden uit pollen en nectar werden gedetecteerd en voorlopig geïdentificeerd door MS met hoge resolutie. Fragmentatie verkregen door botsing-geïnduceerde dissociatie hielp bij de identificatie. Alkaloïdeconcentraties werden berekend op basis van een aconitine standaardcurve in MeOH en uitgedrukt als “aconitine-equivalent”. Geanalyseerde alkaloïden werden geselecteerd op basis van hun aanwezigheid in andere Aconitum-species4,8.

nectarproductie en suikersamenstelling

Nectar werd verzameld in glazen capillairbuizen van 5 µL (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Duitsland) uit bloemen van de planten die in de groeikamers van de universiteitscampus werden overgebracht (geen insectenbezoek). We schatten de nectar productie trend gedurende de dag aan het begin van de anthese door het bemonsteren van 2 bloemen van 12 individuen elke 2 uur gedurende 10 uur. We hebben ook de totale nectarproductie per bloem (2 bloemen van 12 personen) gemeten voor dezelfde bloemen om de 2 dagen gedurende de gehele (9 dagen) bloeiperiode, elke dag op hetzelfde tijdstip, 2 uur nadat het licht was ingeschakeld. De totale productie voor de mannelijke en vrouwelijke fasen werd geschat op basis van bemonstering aan het einde van de mannelijke (5 dagen na de anthese) en vrouwelijke (8 dagen) fasen.

Nectarmonsters werden bewaard bij -80 °C totdat chemische analyses werden uitgevoerd. Na afleiding werden suikeridentificatie en kwantificering uitgevoerd door GC-MS (Thermo Trace 1310 /Thermo ISQ-QD). Een Restek RXI-5Sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 µm df) kolom werd gebruikt. Het debiet was 1,0 mL min−1 (helium). De geïnjecteerde splitsingsverhoudingen waren 1/10 voor de hexoses en 1/100 voor sucrose. De volgende inlaatomstandigheden werden toegepast: oventemperatuur, 105 °C gedurende 4 min, vervolgens 280 °C bij 15 ° C min−1 (gedurende 20 min) en injectortemperatuur van 250 °C.Het totale suikergehalte van nectar per bloem (mg) werd vervolgens berekend als volume nectar (µL) x totale suikerconcentratie (mg/µL).

Insectengedrag

in 2011 en 2012 vonden onderzoeken plaats bij de vier resterende natuurlijke populaties in Venen in Zuid-België. Van deze, het natuurreservaat “Les Abattis” (49°40’50″N; 5°32’59″E) bevat de grootste en dichtste bevolking (2970 m2 met 1330 ± 1030 A. napellus bloemen m-2). Op “Fouches” (49 ° 4 ‘ 8 “N; 5°43′ 06 ” E), die de tweede grootste populatie heeft (1788 m2), individuen van A. napellus waren zeer verspreid over het gebied en bij veel lagere dichtheden (176 ± 177 bloemen m−2) “Chantemelle’ (49°39’37″N; 5°39’37″E)’ had een discontinue populatie bestaande uit drie plekken (161, 423 en 500 m2) met relatief lage plant−en bloemdichtheden (179 ± 125 bloemen m-2). “Sainte-Marie”(49°40’06″NB; 5°32’56” ol) had een kleine en fragmentarische bevolking (292 m2, 152 ± 163 bloemen m−2) strekt zich uit over 150 m langs een voormalige spoorlijn.

Bloembezoekers werden waargenomen in 10 minuten tijdens de piekbloei op drie opeenvolgende dagen in 2011 (tussen 30 augustus en 3 September) en op vier dagen in 2012 (tussen 21 en 27 augustus) bij droge en warme weersomstandigheden. Het aandeel van de mannelijke fase bloemen, tijdens deze dagen en in alle populaties, was hoger dan de vrouwelijke fase bloemen (ongeveer 85%). Bloemen binnen 1 m2 (of ongeveer vijf planten) werden tegelijkertijd waargenomen. Er werden minimaal tien waarnemingen per populatie uitgevoerd (maximaal 16), verspreid over de gehele populatie en over verschillende tijden gedurende de dag. Voor elke bezoeker registreerden we de soort, het aantal bezochte en niet-geroofde bloemen per plant en per stuk, de tijd die ze per enkele bloem doorbrachten en hun foerageergedrag (pollen-of nectarverzameling, legitiem of onwettig bezoek, aangeduid als robbing (basiswerkend, primair en secundair robbend). Tijdens 530 min van bloem observaties in 2011 en 400 min in 2012, registreerden we 183 bloem bezoekers. Hommels (B. pascuorum en B. hortorum) en honingbijen (Apis mellifera) waren de belangrijkste bloembezoekers; slechts 3 exemplaren van B. terrestris werden waargenomen.

Pollen draagvermogen

dertig individuen per soort werden gedood met ethylacetaat en individueel opgeslagen. Stuifmeel werd uit de verschillende lichaamsdelen van insecten verwijderd met kleine blokjes gelatine-glycerine53. Pollenkorrels geconcentreerd in de corbicula werden verwijderd en niet opgenomen in analyses. Alle stuifmeelkorrels werden geteld door lichtmicroscopie.

pollenverzameling zuiverheid

we hebben pollenladingen bemonsterd van hommels die A. napellus bezochten in de natuurlijke populaties. In het lab waren pollenladingen acetolysed53. Ten minste 400 willekeurig gekozen pollenkorrels van elk van de 25 pollen ladingen werden geïdentificeerd en geteld onder lichtmicroscopie.

Gustatoire reacties van insectenbezoekers

we volgden het protocol van Ma et al.54 voor aconitine detectie. Wanneer ze gevangen werden, werden individuele bijen gedurende 3 uur uitgehongerd in een plastic flacon (7 cm lang, 2,8 cm binnendiameter) bij kamertemperatuur en in volledige duisternis in het lab. We hebben elke bij overgebracht naar een holding tube, een 15-mL centrifugebuis met een 4-mm gat geboord aan de punt en een stuk van stalen gaas bevestigd binnen. Na een pre-test fase met een druppel sucrose, presenteerden we de testoplossing in een 100-µL glazen capillaire buis en kneep de buis voorzichtig om de oplossing op de punt van de buis te houden. Elk insect dat na 5 minuten geen slurfuitbreiding had, werd uit de test verwijderd. De testfasen duurden 2 minuten en het volume van de oplossing voor en na de test werd met een remklauw geregistreerd.

Tests werden uitgevoerd met drie soorten bezoekers (A. mellifera, B. pascuorum en B. terrestris). Tien individuen per insectensoort werden met elke oplossing getest. Sucrose (430 µg mg−1) en aconitine (232 µg g−1) concentraties kwamen overeen met die gevonden in onze soort. Er werden drie oplossingen voorgesteld: gedeïoniseerd water alleen (controle), zuivere sucrose-oplossing en sucrose plus aconitine-oplossing.

voor alle tests werd voor elke proefpersoon een afschrikkingsindex berekend op basis van de keuze om te drinken, het volume van de geconsumeerde oplossing en het tijdstip van contact met de oplossing als volgt:: ID = 1 – (keuze voor sucrose/keuze voor sucrose + aconitine) × (verbruikte hoeveelheid sucrose/verbruikte hoeveelheid sucrose + aconitine) × (tijd van contact met sucrose-oplossing/tijd van contact met sucrose + aconitine-oplossing).

statistische analyses

de normaliteit van de gegevens werd geschat met behulp van Shapiro–Wilk-tests, en homoscedasticiteit werd geverifieerd met behulp van de tests van Levene. Wanneer aan normaliteit en homoscedasticiteit werd voldaan, werden variantieanalyses (Anova ‘ s) uitgevoerd (floral phase effect op Floral vluchtige stoffen). Anders, nonparametric tests werden uitgevoerd met behulp van de Wilcoxon test voor de vergelijking van de twee voorwaarden (bloemen fase effect op de bloem morfologie en nectar parameters) en Kruskall-Wallis test voor de vergelijking van meer dan twee voorwaarden (insect en het oplossend effect op het verbruikte volume en neem contact op met de duur met de oplossing in de smaak experimenten, insecten effect op de visitatie gedrag) en chi-square tests werden uitgevoerd om het vergelijken van de percentages van personen in de smaak experimenten. ANOVA-en niet-parametrische analyses werden gevolgd door multi-paarsgewijze vergelijking wanneer meer dan twee voorwaarden werden vergeleken. Alle analyses werden uitgevoerd in SAS Enterprise Guide 7.1. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± standaardafwijkingen.