uitvoering van HPLC

Inleiding

hogedrukvloeistofchromatografie is in principe een sterk verbeterde vorm van kolomchromatografie. In plaats van een oplosmiddel door een kolom te laten druppelen onder zwaartekracht, wordt het onder hoge druk tot 400 atmosferen erdoor gedrukt. Dat maakt het veel sneller.

het maakt het ook mogelijk om een veel kleinere deeltjesgrootte te gebruiken voor het kolomverpakkingsmateriaal, wat een veel groter oppervlak geeft voor interacties tussen de stationaire fase en de moleculen die erlangs stromen. Dit zorgt voor een veel betere scheiding van de componenten van het mengsel.

de andere belangrijke verbetering ten opzichte van kolomchromatografie betreft de detectiemethoden die kunnen worden gebruikt. Deze methoden zijn zeer geautomatiseerd en uiterst gevoelig.

de kolom en het oplosmiddel

verwarrend genoeg zijn er twee varianten in gebruik in HPLC afhankelijk van de relatieve polariteit van het oplosmiddel en de stationaire fase.

normale fase HPLC

Dit is in wezen precies hetzelfde als u al hebt gelezen in dunnelaagchromatografie of kolomchromatografie. Hoewel het als “normaal” wordt beschreven, is het niet de meest gebruikte vorm van HPLC.

de kolom is gevuld met kleine silica-deeltjes en het oplosmiddel is bijvoorbeeld apolair – hexaan. Een typische kolom heeft een inwendige diameter van 4,6 mm (en kan kleiner zijn) en een lengte van 150 tot 250 mm.

polaire verbindingen in het mengsel dat door de kolom wordt gevoerd, zullen langer aan het polaire siliciumdioxide kleven dan niet-polaire verbindingen. De apolaire passeert daardoor sneller door de kolom.

Reversed phase HPLC

In dit geval is de kolomgrootte hetzelfde, maar het silica wordt aangepast om het apolair te maken door lange koolwaterstofketens aan het oppervlak te bevestigen-meestal met 8 of 18 koolstofatomen erin. Een polair oplosmiddel wordt gebruikt-bijvoorbeeld een mengsel van water en een alcohol zoals methanol.

In dit geval zal er een sterke aantrekkingskracht zijn tussen het polaire oplosmiddel en de polaire moleculen in het mengsel dat door de kolom wordt doorgegeven. Er zal niet zo veel aantrekkingskracht zijn tussen de koolwaterstofketens verbonden aan het silica (de stationaire fase) en de polaire moleculen in de oplossing. Polaire moleculen in het mengsel zullen daarom het grootste deel van hun tijd besteden aan het bewegen met het oplosmiddel.

apolaire verbindingen in het mengsel zullen door de dispersie krachten van Van der Waals de neiging hebben om attracties te vormen met de koolwaterstofgroepen. Ze zullen ook minder oplosbaar in het oplosmiddel vanwege de noodzaak om waterstofbindingen te breken als ze knijpen tussen de water-of methanolmoleculen, bijvoorbeeld. Ze besteden daarom minder tijd in oplossing in het oplosmiddel en dit zal hen vertragen op hun weg door de kolom.

dat betekent dat het nu de polaire moleculen zijn die sneller door de kolom zullen reizen.

Reversed phase HPLC is de meest gebruikte vorm van HPLC.