GDF11PRO-Fc bindt aan zowel GDF11 en MSTN

om aan Te tonen dat GDF11PRO-Fc kan beslag te leggen op de actieve volwassen GDF11 dimeer via een directe interactie, we gericht op het identificeren van een eiwit-eiwit interactie tussen GDF11 en GDF11PRO-Fc. Bovendien, als gevolg van de nauwe structurele homologie van de GDF11 en MSTN mature dimeren, wilden we ook bepalen of GDF11PRO-Fc associeert met MSTN. Om deze eiwit-eiwitinteracties te identificeren, voerden we een reeks pull-down assays uit (Fig. 1). De liganden rGDF11, rMSTN en rActivin A werden geïncubeerd met lysaatfracties van HEK293 cellen getransfecteerd met een plasmide die codeert voor GDF11PRO-Fc of MPRO-Fc bij pH 7,4. Als gevolg van de geconjugeerde Fc fragmenten op de gemodificeerde propeptiden, fracties kunnen worden getrokken rechtstreeks op een eiwit A/G agarose hars. Zoals verwacht trok GDF11PRO-Fc effectief zowel rGDF11 als rMSTN naar beneden, wat aangeeft dat GDF11PRO-Fc in staat was om beide liganden te binden. Daarnaast heeft MPRO-Fc met succes zowel rGDF11 als rMSTN neergehaald. Zowel GDF11PRO-Fc als MPRO-Fc waren niet in staat om de meer ver verwante TGF-β superfamily ligand rActivin A naar beneden te halen, wat erop wijst dat de ligandbinding specifiek is (Fig. 1). Er werd geen binding van GDF11PRO-Fc, MPRO-Fc, rGDF11, rMSTN of ractivine a waargenomen op een controleagarosehars zonder eiwit A / G. Uit deze resultaten concluderen we dat GDF11PRO-Fc spontaan associeert met de volwassen GDF11-en MSTN-dimeren bij fysiologische pH.

GDF11PRO-Fc associates with GDF11 and MSTN. Eiwit-eiwitinteracties tussen GDF11PRO-Fc of MPRO-Fc en rGDF11, rMSTN of ractivine A werden bepaald door een pull-down assay. GDF11PRO-Fc of MPRO-Fc werd geïncubeerd met rGDF11, rMSTN of rActivin a gedurende 1 uur bij 4 °C. Fc-fused eiwitcomplexen werden gescheiden op een eiwit A / G-gecoate agarose hars en eluaten werden uitgevoerd op een 12% SDS-pagina gel onder het verminderen van omstandigheden en gesondeerd door western blot. Invoercontrole was 5% van het inputmateriaal. WB western blot

GDF11PRO-Fc blokken GDF11/MSTN-geïnduceerde atrofie in C2C12 myotubes

toevoeging van rGDF11 en rMSTN aan gedifferentieerde myotubes is eerder aangetoond dat atrofie in muriene C2C12 en primaire humane skeletachtige myotubes induceert . Na te hebben vastgesteld dat GDF11PRO-Fc bindt GDF11 en MSTN, vroegen we vervolgens of GDF11PRO-Fc kon voorkomen dat GDF11/MSTN-geïnduceerde myotube atrofie in gedifferentieerde C2C12 myotubes. Om dit te bereiken, verpakten we de DNA-sequentie codering voor GDF11PRO-Fc in de aav6 capsid om de aav6-GDF11PRO-Fc vector te genereren. In deze experimenten, werd de vector AAV6 geselecteerd voor zijn capaciteit om gedifferentieerde C2C12 myotubes efficiënt en selectief, maar niet myoblasten om te zetten . C2C12 myoblasten werden gekweekt en gedifferentieerd gedurende 5 dagen voorafgaand aan de behandeling met AAV6-GDF11PRO-Fc of AAV6-EGFP (controlevector) bij een MOI van 105 (Fig. 2 bis). Zoals verwacht, was de uitdrukking GFP waarneembaar in C2C12 myotubes die met AAV6-EGFP bij 48-72 h post-besmetting worden besmet, en de kwantificering van geïnternaliseerde vectorgenoomkopieën per diploïde genoom bij 72 h post-besmetting wees erop dat vectortransductie adequaat werd bereikt (Fig. 2b en c).

GDF11PRO-Fc blokkeert GDF11/MSTN-geïnduceerde myotube atrofie in C2C12-cellen. een schematische detaillering experimentele tijdlijn in C2C12 myotubes. AAV6-EGFP of AAV6-GDF11PRO-Fc werd toegevoegd aan C2C12 myotubes met een MOI van 105 op dag 5 post-differentiatie en 100 ng/ml rGDF11 of rMSTN werd toegevoegd op dag 7. Myotubes werden gekleurd en geanalyseerd op dag 10. B EGFP expressie was duidelijk bij 48-72 uur in C2C12 myotubes behandeld met AAV6-EGFP (MOI 10 ). Schaal bars vertegenwoordigt 50 µm. C het vectoraantal van het genoomkopie per diploïde genoom in C2C12 myotubes 72 h na toevoeging van AAV6-EGFP of AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10). d representatieve immunofluorescentiebeelden van C2C12 myotubes. C2C12 myotube membranen werden gevisualiseerd door kleuring met een anti-dystrofine antilichaam (rood). Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Inzet toont een ingezoomd gebied. Schaal bars vertegenwoordigen 50 µm (hoofdpaneel) en 25 µm (Paneel inzet). e de fractie van kernen in myotubes (differentiatieindex) werd berekend en gepresenteerd als een percentage van de controle. f gemiddelde diameter van de myotube ten opzichte van de controle en (g) verdeling van de diametermetingen. Voor metingen van de diameter van de myotube werd elke myotube gemeten op drie punten langs de lengte van de myotube en gemiddeld. h aantal ingebouwde kernen per myotube. Een minimum van 50 myotubes werden geanalyseerd per experimentele toestand. I psmad2/3 ten opzichte van tsmad2 / 3 werd beoordeeld door western blot. Gelijke eiwitbelasting werd geverifieerd door Ponceau s kleuring en GAPDH werd gebruikt als een belastingcontrole. De gegevens vertegenwoordigen de resultaten van drie afzonderlijke experimenten. Alle foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Tweeënzeventig uur later werden myotubes gefixeerd en gekleurd voor immunofluorescentieanalyse met behulp van een antilichaam dat dystrofine herkent (rod 22/rod 23) om myotube perifere membranen te visualiseren en DAPI om myonuclei te bevlekken (Fig. 2d). Een reductie in de differentiatieindex, die wordt gedefinieerd als het aandeel myonuclei dat in myotubes is opgenomen, werd waargenomen in myotubes die werden behandeld met rGDF11 (− 15%, p = 0,0008) of rMSTN (− 14%, p = 0,0013) ten opzichte van onbehandelde controle. Dit effect werd echter afgezwakt in gdf11pro-Fc-expressie C2C12 myotubes behandeld met rGDF11 (− 1,9%; p = 0.0047, vergeleken met rgdf11-behandelde controle) of rMSTN (- 3,0%; p = 0,0040, vergeleken met rmstn-behandelde controle; Fig. 2e). Bovendien verzette C2C12 myotubes die werden behandeld met AAV6-GDF11PRO-Fc zich tegen rGDF11 of rMSTN-veroorzaakte myotube atrofie. Een aanzienlijke afname van de gemiddelde myobuisdiameter ten opzichte van de controlegroep werd gedetecteerd in myobuisjes behandeld met rGDF11 (− 39%; 0,0002) of rMSTN (− 35%; p = 0,0003) vergeleken met de controlegroep. Integendeel, myotubes met expressie van GDF11PRO-Fc behandeld met rGDF11 (- 1,8%; p = 0,0005, vergeleken met rgdf11-behandelde controle) of rMSTN (- 5,3%; p = 0.0075, vergeleken met rmstn-behandelde controle) waren grotendeels onaangetast (Fig. 2f en g). In een afzonderlijk experiment was GDF11PRO-Fc niet in staat om rActivin a-geïnduceerde myotube atrofie te voorkomen, wat in overeenstemming is met de observatie dat gdf11pro-Fc activin A niet bindt (aanvullend bestand 1: Figuur S3).

behandeling met rGDF11 of rMSTN werd ook geassocieerd met een lager percentage volwassen myotubes met hogere aantallen myonuclei, wat wijst op een remming van myotube-differentiatie. Myotubes met meer dan 11 myonuclei bestonden slechts 5,2% (p = 0,0215) en 7,2% (p = 0.0328) van myotubes geanalyseerd in cellen behandeld met rGDF11 en rMSTN, respectievelijk. Ter vergelijking, myotubes met meer dan 11 kernen vormden 26% van myotubes geanalyseerd in controle myotubes. In myotubes met expressie van GDF11PRO-Fc die werden behandeld met rGDF11 of rMSTN, was het aandeel myotubes met meer dan 11 myonuclei respectievelijk 22% (p = 0,0104, vergeleken met rgdf11-behandelde controle) en 19% (p = 0,0404, vergeleken met rMSTN-behandelde controle) (Fig. 2h). Tenslotte, in overeenstemming met wat zou worden verwacht na GDF11/MSTN signalering bij ActRII, een verhoging van gefosforyleerde smad2/3 (pSMAD2/3) eiwitspiegels in myotubes behandeld met AAV6-EGFP en rGDF11 of rMSTN was waarneembaar op western blot 24 uur na toevoeging van ligand (Fig. 2i). Deze toename van psmad2 / 3-niveaus was afwezig in myotubes die werden behandeld met AAV6-GDF11PRO-Fc, wat erop wijst dat de expressie van GDF11PRO-Fc de door GDF11/MSTN geïnduceerde activering van SMAD2/3 in gedifferentieerde myotubes tegenwerkt. Over het algemeen wijzen deze resultaten erop dat GDF11PRO-Fc in staat was om rgdf11 en rMSTN-geïnduceerde myotube atrofie en remming van differentiatie in C2C12 cellen te voorkomen.

gelokaliseerde gdf11pro-Fc expressie induceert skeletspierhypertrofie bij volwassen muizen

eerder hebben we aangetoond dat systemische AAV vectorgemedieerde genafgifte van GDF11PRO-Fc bij neonatale muizen leidde tot een significante toename van de groei van skeletspieren . Nochtans, was het onduidelijk uit deze studie of gdf11pro-Fc eenvoudig de skeletspiergroei verbeterde of eigenlijk skeletspierhypertrofie veroorzaakte. Bovendien was het niet mogelijk om vast te stellen of de effecten van GDF11PRO-Fc werden gemedieerd door lokale blokkade van GDF11/MSTN in skeletspieren of of de waargenomen effecten te wijten waren aan systemische modulatie van GDF11/MSTN. Om deze vragen te beantwoorden, evalueerden we de impact van intramusculaire toediening AAV9-GDF11PRO-Fc in volwassen c57bl/6J muizen. In deze studies werd alleen de rechter-achterpoot geïnjecteerd, en de contralaterale linker-achterpoot werd gebruikt als controle.

lichaamsgewicht nam in de loop van de tijd licht toe bij muizen die werden behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 10% na 10 weken; p = 0,0418; Fig. 3a). Bovendien was de op het lichaamsgewicht genormaliseerde gripsterkte van één achterbeen significant verhoogd in beide individueel geteste ledematen, waarbij de grotere omvang van het effect werd waargenomen in de behandelde rechter achterbeen (+ 37%; p = 0,0177), hoewel ook een significante toename van de genormaliseerde gripsterkte werd waargenomen in de onbehandelde linker achterbeen (+ 18%; p = 0,0426). Dit verschil werd echter niet significant toen beide achterpoten gelijktijdig werden getest (+15%; p = 0,2375; Fig. 3b). Tien weken na toediening van de vector was de rechter achterpoot zichtbaar groter bij muizen die werden behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3c). Bij muizen die werden behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc was de natte weefselmassa van de geïnjecteerde rechter tibialis anterior (+ 50%; p = 0,0046) en gastrocnemius (+ 37%; p = 0,0023) significant hoger in vergelijking met de vehiculumbehandelde controlegroep. Er was geen statistisch significant verschil in de natte weefselmassa van de onbehandelde linker achterpootspieren (Fig. 3d). Analyse van het myofibergebied toonde een toename aan van het gemiddelde myofiberdoorsnede gebied (+15%; p = 0.0078) in de aav9-Gdf11pro-Fc-geïnjecteerde rechter gastrocnemius (Fig. 3e en f). MFD distributie analyse toonde ook een verschuiving naar grotere myofibers in de rechterkant gastrocnemius van muizen geïnjecteerd met AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3g), wat erop wijst dat gelokaliseerde gdf11pro-Fc expressie spierhypertrofie induceerde. In een aparte cohort, we ook beoordeeld de impact van gelokaliseerde gen levering van GDF11 door een intramusculaire injectie van AAV9-GDF11 in de rechter achterpoot, en significante spieratrofie werd waargenomen 10 weken na de behandeling in de geïnjecteerde achterpoot (aanvullend bestand 1: Figuur S4).

GDF11PRO-Fc induceert gelokaliseerde skeletspierhypertrofie na intramusculaire genafgifte. 8 weken oude c57bl / 6J muizen werden behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 5) of vehiculum (n = 5) via unilaterale intramusculaire injectie in de rechter achterpoot. De contralaterale linker achterpoot werd niet behandeld. Muizen werden 10 weken na de behandeling geëuthanaseerd. een gemiddeld lichaamsgewicht na verloop van tijd. b achterpoten gripsterkte genormaliseerd tot lichaamsgewicht 10 weken na de behandeling. Afgebeeld zijn metingen van een enkele achterpoot en beide achterpoten. C representatieve bruto achterpootspier. De ingespoten achterpoot wordt aangeduid met een zwarte pijl. d gewicht van het natte weefsel van tibialis anterior en gastrocnemius. e representatieve immunofluorescentiebeelden van geïnjecteerde rechter gastrocnemius dwarsdoorsneden gekleurd met AlexaFluor-488-geconjugeerde WGA om myofibers te visualiseren. Schaal bars vertegenwoordigen 100 µm. f gemiddelde myofiber dwarsdoorsnede in de geïnjecteerde rechter gastrocnemius. g Myofiber MFD verdeling in de geïnjecteerde rechter gastrocnemius. Per muis werden minimaal 500 myofibers gemeten. h Western blot identificatie van GDF11PRO-Fc in weefsellysaten van geïnjecteerde rechter gastrocnemius en levermonsters van behandelde muizen. GDF11PRO-Fc was niet detecteerbaar bij met het voertuig behandelde muizen. Gelijke eiwitbelasting werd geverifieerd door Ponceau s kleuring en GAPDH werd gebruikt als een belastingcontrole. Alle foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. *p < 0,05; * * p < 0,01; n.s. niet significant; vergeleken met met voertuigen behandelde controle. TA tibialis anterior, Gas gastrocnemius

Western blot analysis gaf aan dat het gdf11pro-Fc-eiwit werd uitgedrukt in de aav9-Gdf11pro-Fc-geïnjecteerde rechtergastrocnemius (58 kDa band; Fig. 3h). GDF11PRO-Fc was echter niet detecteerbaar in de onbehandelde linker gastrocnemius bij dezelfde hoeveelheid geladen eiwit, wat erop wijst dat de meerderheid van de skelet spier gdf11pro-Fc expressie gelokaliseerd was op de geïnjecteerde rechter achterpoot (gegevens niet getoond). GDF11PRO-Fc was ook detecteerbaar in de lever door western blot, wat erop wijst dat er enige systemische blootstelling was opgetreden (Fig. 3h). Deze waarneming kan hoogstwaarschijnlijk worden toegeschreven aan vasculaire lekkage van de aav9-vector in de systemische circulatie vanaf de injectieplaats . Op basis van deze gegevens bepalen we dat GDF11PRO-Fc skeletspierhypertrofie induceert bij volwassen muizen. Bovendien worden deze effecten ten minste gedeeltelijk gemedieerd door lokale blokkade van GDF11/MSTN op skeletspieren, waarschijnlijk door remming van ligandinteracties met ActRII op skeletspierweefsel.

systemische gdf11pro-Fc genafgifte verhoogt skeletspiermassa en sterkte bij MDX-muizen

vervolgens hebben we de impact van systemische gdf11pro-Fc expressie bij MDX-muizen geëvalueerd om te bepalen of GDF11PRO-Fc ook hypertrofie kan induceren en de sterkte van dystrofische skeletspieren kan verhogen. In het kader van dit onderzoek werd het gdf11pro-Fc-construct gewijzigd met een mutatie om het ongevoelig te maken voor endogene bmp1/TLD-achtige metalloproteïnase-splitsing (GDF11PRO-Fc D122A) en de persistentie van factor in de systemische circulatie te verhogen . Voor deze experimenten werden zowel AAV9-Gdf11pro-Fc als AAV9-Gdf11pro-Fc D122A geëvalueerd om vast te stellen of het gemuteerde d122a transgeen in vivo tot een meer uitgesproken effect zou leiden. Om systemische expressie te bereiken, werden MDX-muizen behandeld met vector of vehiculum door injectie van de staartader. Na intraveneuze toediening transduceert de AAV9 vector de muizenlever met een hoog rendement. Transduced hepatocytes kunnen dan het transgen uitdrukken en het eiwitproduct in systemische circulatie afscheiden .

vanaf 3 weken na injectie zagen we een significante toename in lichaamsgewicht die aanhield gedurende de duur van het onderzoek met AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 7,7% na 12 weken; p = 0,0094) en AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 11% na 12 weken; p = 0,006) behandeling (Fig. 4a). Opgemerkt moet worden dat, als gevolg van de dystrofische pathologie, MDX muizen meestal vertonen compenserende spierhypertrofie, die gedeeltelijk kan maskeren de toename van spiermassa veroorzaakt door gdf11pro-Fc expressie. Met betrekking tot spierfunctie testen, behandelde muizen weergegeven verhoogde voorpoten grip sterkte, zelfs na het normaliseren van het lichaamsgewicht. Het verschil in genormaliseerde voorpootgreepsterkte bereikte echter alleen statistische significantie in de AAV9-Gdf11pro-Fc D122A-groep. 12 weken na de behandeling was de gemiddelde genormaliseerde voorpootgreepsterkte verhoogd met + 28% (p = 0,0873) en + 36% (p = 0,0248) bij muizen behandeld met respectievelijk AAV9-GDF11PRO-Fc en AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (Fig. 4b). De prestaties van Rotarod werden ook verbeterd door gemiddeld AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-behandeling (+ 93% toename van de latentietijd van rotarod; p = 0,0127). De prestaties van Rotarod werden ook verbeterd in de AAV9-GDF11PRO-Fc-groep, maar dit verschil bereikte geen statistische significantie (+44% toename van de rotarod latentietijd; P = 0,2835; Fig. 4c). Er werd geen verschil waargenomen in de looptijd van de loopband tussen de groepen (Fig. 4d).

GDF11PRO-Fc verbetert de gripsterkte en de rotarod-prestaties bij dystrofische MDX-muizen. 6 weken oude MDX muizen werden behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7), of vehiculum (n = 7) via injectie van de staartader. een gemiddeld lichaamsgewicht na verloop van tijd. b voorpoot grip sterkte genormaliseerd naar lichaamsgewicht na verloop van tijd. C beste rotarod tijd-tot-Val geregistreerd van voor de behandeling (baseline) en 12 weken na de behandeling. De beste tijd van drie pogingen werd gebruikt voor analyse. d totale afstand van de loopband endurance test vanaf voor de behandeling (baseline) en 12 weken na de behandeling. Alle foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; n.s. niet significant; vergeleken met vehiculum-behandelde controle

aan het einde van het 12 weken durende onderzoek was spierhypertrofie duidelijk zichtbaar bij de behandelde muizen (Fig. 5a). De gemiddelde natte weefselmassa van de tibialis anterior, gastrocnemius en quadriceps nam toe met + 17% (p = 0,0472), + 20% (p = 0,0011) en + 14% (p = 0.0333), respectievelijk, in de AAV9-Gdf11pro-Fc-groep. In de AAV9-Gdf11pro-Fc D122A-groep werden deze waarden verder verhoogd tot + 26% (p = 0,0030), + 31% (p = 0,0003) en + 23% (p = 0,0009) ten opzichte van de vehiculum-behandelde controle voor de verandering in de gemiddelde tibialis anterior massa, gastrocnemius massa en quadriceps massa, respectievelijk. Bovendien was de natte weefselmassa in het middenrif verhoogd met + 19% (p = 0,0162) en + 26% (p = 0,0014) in respectievelijk de AAV9-GDF11PRO-Fc en AAV9-GDF11PRO-Fc D122A groepen. Interessant is dat de hartmassa niet significant werd veranderd door de behandeling. Het gemiddelde gastrocnemius myofiber dwarsdoorsnede gebied was hoger bij muizen behandeld met AAV9-Gdf11pro-Fc (+ 23%; p = 0,0226) en AAV9-Gdf11pro-Fc D122A (+ 25%; p = 0,0170; Fig. 5c en d). In de MFD distributie analyse, MFD neigde naar piek rond 20-30 µm over alle groepen, wat waarschijnlijk toe te schrijven is aan het hogere aandeel van kleine regenererende myofibers in dystrofische spier. Behandeling met AAV9-GDF11PRO-Fc en AAV9-GDF11PRO-Fc D122A resulteerde echter wel in een verhoogd percentage myofibers met MFA ‘ s hoger dan 64 µm, wat erop wijst dat de factorexpressie myofiberhypertrofie had veroorzaakt (Fig. 5e) in skeletspieren.

GDF11PRO-Fc induceert skeletspierhypertrofie bij dystrofische MDX muizen. 6 weken oude MDX muizen werden behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7), of vehiculum (n = 7) via injectie van de staartader. Muizen werden 12 weken na de behandeling geëuthanaseerd. een representatieve bruto achterpootspier. B nat weefsel gewicht van ledematen spieren, middenrif, en hart. C representatieve immunofluorescentiebeelden van gastrocnemius dwarsdoorsneden gekleurd met AlexaFluor-488-geconjugeerde WGA om myofibers te visualiseren. Schaal bars vertegenwoordigen 100 µm. d gemiddelde myofiber dwarsdoorsnede in de gastrocnemius. e Myofiber MFD distributie in de gastrocnemius. Per muis werden minimaal 500 myofibers gemeten. F Identificatie van gdf11pro-Fc door western blot in leverweefsel lysaat en serum van muizen behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc. Gelijke eiwitbelasting werd geverifieerd door Ponceau s-kleuring en GAPDH werd gebruikt als loadingcontrole in lysaten van leverweefsel. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; n.s. niet significant; vergeleken met met het voertuig behandelde controle

Western blot analyse bevestigde eiwitexpressie van de transgenen in lever en serum. Zoals verwacht was de band van 58 kDa, overeenkomend met GDF11PRO-Fc of Gdf11pro-Fc D122A, detecteerbaar bij behandelde muizen. De serumspiegels van het volledige propeptide waren iets hoger bij muizen die werden behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc D122A dan bij muizen die werden behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc, wat erop wijst dat de serum persistentie van het actieve propeptide werd verhoogd door de d122a-mutatie (Fig. 5f).

in het algemeen wijzen deze resultaten op een systemische expressie van GDF11PRO-Fc en Gdf11pro-Fc D122A op een toename van de skeletspiermassa bij dystrofische MDX-muizen en dat deze hypertrofie van de skeletspieren gepaard gaat met verbeteringen in de gripsterkte en motorische coördinatie. De behandeling leek echter geen invloed te hebben op het uithoudingsvermogen van de spieren op basis van de hardloopprestaties van de loopband. Bovendien bleek de d122a mutant iets effectiever in het verhogen van spiermassa en functie, vermoedelijk als gevolg van verbeterde serum persistentie.

systemische gdf11pro-Fc genafgifte vermindert de dystrofische pathologie bij MDX-muizen niet

een aantal studies heeft gemeld dat blokkade van TGF-β-ActRII-SMAD2 / 3-signalering, hetzij door mstn-remming of blokkade van ActRII, therapeutisch voordeel kan hebben in diermodellen van DMD . Om de impact van AAV9-GDF11PRO-Fc behandeling op de dystrofische pathologie te bepalen, hebben we histologische analyse van ledematen spieren en het middenrif uitgevoerd.

karakteristieke tekenen van de dystrofische pathologie, waaronder spiernecrose, centrale nucleatie, intramusculaire collageendepositie en de aanwezigheid van inflammatoire infiltraten waren duidelijk in alle MDX-groepen (Fig. 6 bis). In de gastrocnemius was het percentage fibrotische oppervlakte verminderd met − 39% (p = 0,0273) bij muizen die werden behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc. Fibrose in de gastrocnemius was ook licht verlaagd in de AAV9-Gdf11pro-Fc D122A groep; vanwege de grote intersubject variabiliteit in intramusculaire fibrose van de ledematen, bereikte dit verschil echter geen statistische significantie (− 28%; p = 0,1230; Fig. 6b). Er werd ook geen significant verschil waargenomen in het aandeel myofibers met een centrale kern, wat erop wijst dat myofiberregeneratie actief voorkwam in alle groepen (Fig. 6c). Serum CK, een marker van spierafbraak, werd ook niet significant veranderd door behandeling (Fig. 6d). Bovendien was in alle MDX-groepen een gelokaliseerde verslechtering van de myofiber-membraanintegriteit, gemeten door anti-muis IgG-immunofluorescentiekleuring, duidelijk. Onverwacht, MDX muizen behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc D122A vertoonde een lichte toename van IgG-positieve gebied gemiddeld, maar dit verschil bereikte geen statistische significantie (+55%; p = 0,1729; Fig. 6e en f; aanvullend bestand 1: Figuur S5). Duidelijke tekenen van myofibernecrose, regeneratie, centrale nucleatie en IgG penetrantie waren niet zichtbaar in het wilde type c57bl / 10J gastrocnemius, wat erop wijst dat deze markers specifiek zijn voor de dystrofische pathologie (Fig. 6a-f; aanvullend bestand 1: Figuur S5).

GDF11PRO-Fc verzacht de dystrofische pathologie bij MDX-muizen niet. 6 weken oude MDX muizen werden behandeld met AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) of vehiculum (n = 7) via injectie van de staartader. Op leeftijd afgestemde c57bl / 10J (n = 5) muizen werden ook opgenomen als wild type controle. Muizen werden 12 weken na de behandeling geëuthanaseerd. een representatieve He en MTC kleuring van gastrocnemius dwarsdoorsneden van c57bl / 10J en MDX muizen. Centrale nucleatie is duidelijk in alle MDX-groepen. Gelokaliseerde gebieden van myofiber necrose en regeneratie zijn gemarkeerd met een zwarte pijl. Het fibrotische gebied wordt vertegenwoordigd door het blauwe gebied op MTC het bevlekken. De staven vertegenwoordigen 50 µm in he-secties en 100 µm in MTC-secties. b fibrotisch gebied in de gastrocnemius uitgedrukt als percentage van het totale oppervlak van de spierdoorsnede. c Percentage van de myofibers met centrale nucleatie. d meting van de circulerende spiegels van serum-CK, een marker van spierbeschadiging. e representatieve immunofluorescentiebeelden van IgG-kleuring van muizen (rood) in gastrocnemius weefseldoorsneden. De positieve kleuring voor IgG wijst op myofiberpermeabiliteit voor serumeiwitten en verlies van membraanintegriteit. Secties werden samen met WGA gekleurd om individuele myofibers te visualiseren. Ingezoomd gebied is gemarkeerd met een wit vak. Karakteristieke IgG-positieve myofibers zijn afgebeeld met een witte pijl. Schaal bars vertegenwoordigen 100 µm. f het oppervlak van IgG-positieve myofibers uitgedrukt als een percentage van het totale oppervlak van de spierdoorsnede. g representatieve He en MTC kleuring van membraandoorsneden van c57bl / 10J en MDX muizen. Uitgebreide pathologie is duidelijk in MDX maar niet c57bl/10J muizen. Schaal bars vertegenwoordigen 100 µm. h fibrotisch oppervlak in het middenrif, uitgedrukt als percentage van het totale oppervlak van de dwarsdoorsnede. *p < 0,05; ***p < 0,001; * * * * p < 0,0001; n.s. niet significant; vergeleken met met vehiculum behandelde MDX-controles

in het middenrif, toonde h&e kleuring uitgebreide necrose en intramusculaire collageenafzetting aan in zowel behandelde als onbehandelde MDX-groepen (Fig. 6g). Vergelijkbaar met wat werd waargenomen in de gastrocnemius spier, veroorzaakte de behandeling met AAV9-GDF11PRO-Fc of AAV9-GDF11PRO-Fc D122A een lichte vermindering van de intramusculaire fibrose in het middenrif. Het gemiddelde fibrotische oppervlaktepercentage in het middenrif werd verminderd met 15% (p = 0,0328) en 17% (p = 0.019) met respectievelijk AAV9-GDF11PRO-Fc en AAV9-Gdf11pro-Fc D122A-behandeling (Fig. 6h). Zoals verwacht waren deze pathologische kenmerken grotendeels afwezig in het middenrif van wild type c57bl/10J muizen (Fig. 6g en h). Op basis van deze gegevens bepalen we dat GDF11PRO-Fc en Gdf11pro-Fc D122A in staat zijn om intramusculaire collageenafzetting in de spieren van de ledematen en het middenrif over een periode van 3 maanden licht te remmen. De behandeling lijkt echter de lopende cyclus van spierdegeneratie en-regeneratie in de gastrocnemius of het middenrif van volwassen MDX-muizen niet te stoppen.