absorptiespectra

het absorptiespectrum van thiamine werd geregistreerd tegen water (figuur 1), bleek dat thiamine een maximale absorptiepiek (λ max) vertoont bij 230 nm. Vanwege de sterk blauw verschoven λ max van thiamine, is de bepaling in de doseringsvorm op basis van de directe meting van de absorptie voor ultraviolet gevoelig voor mogelijke interferenties van de veel voorkomende hulpstoffen. Daarom was afleiding van thiamine om zichtbare-bereik absorberende soorten te bereiken ongetwijfeld noodzakelijk. Zo werd derivatisatie van thiamine met NBD-Cl uitgevoerd en werd het absorptiespectrum van het product geregistreerd tegen reagens blanco (figuur 1). Men vond dat het product bruin gekleurd is tentoonstellend λmax bij 434nm, en λmax van NBD-Cl 342nm was. De λmax van thiamine-NBD-Cl derivaat was rood-verschoven, waardoor eventuele interferentie werd geëlimineerd. De golflengte 434 nm werd daarom als optimaal gefixeerd.

optimalisatie van de reactiecondities

De optimale omstandigheden voor de ontwikkelde methode werden vastgesteld door de parameters één voor één te variëren, waarbij de andere parameters constant werden gehouden en na het effect dat werd uitgeoefend op de absorptie van het gekleurde produkt. Om experimentele omstandigheden vast te stellen, werd het effect van verschillende parameters zoals pH, tijd, buffervolume en concentratie van NBD-Cl onderzocht.

Effect van pH

het effect van pH op de reactie tussen thiamine en NBD-Cl werd getest door de pH-vorm 7,0 tot 12,0 te variëren. Zoals weergegeven in Figuur 2 is de absorptie van het product laag bij pH 7,0, wat erop wijst dat thiamine niet kan reageren met (NBD-Cl) in neutrale media. Dit was mogelijk toe te schrijven aan het bestaan van de aminogroep van thiamine in de vorm van hydrochloridezout, die het nucleofiele substitutievermogen belemmert. Aangezien de pH steeg van 7 tot 12, namen de lezingen dramatisch toe, die de aminogroep van thiamine vrijgeven en vergemakkelijkt de nucleofiele substitutie. De maximale absorptie werd bereikt bij een pH-waarde van 10,5. Bij pH-waarden hoger dan 10,5 trad een afname van de absorptie op. Dit werd waarschijnlijk toegeschreven aan de toename van de hoeveelheid hydroxide-ion die de snelheid van de achterwaartse reactie van thiamine met NBD-Cl verhoogt.

Effect van de reactietijd

de absorptie van het reactieproduct werd op verschillende tijdstippen gecontroleerd (Figuur 3). Met behoud van andere omstandigheden werd de absorptie van het reactieproduct gevolgd na verschillende tijdsspanningen bij 25°C. De resultaten tonen aan dat thiamine reageert met NBD-Cl bij 25°C en de absorptie begint geleidelijk te stijgen en na 25 minuten een maximum te bereiken. Voor langere reactietijden werd een lichte daling in de absorptie waargenomen. Dienovereenkomstig werd 25min ingesteld als de geschikte reactietijd voor bepaling.

Effect van de hoeveelheid buffer

Figuur 2: Effect van pH op de reactie van Thiamine met NBD-Cl.
Thiamine (20µg / ml): 1 ml, NBD-CL conc. 0,2% (w / v), reactietijd 20 min.

Figuur 3: Effect van de reactietijd op de reactie van Thiamine met NBD-Cl. Thiamine (20µg / ml) : 1 ml, Buffer (pH 10.5): 1,5 ml, NBD-CL conc. 0,2% (m / v).

bij behoud van de pH op 10,5 werd ook het effect van de hoeveelheid bufferoplossing op de absorptie van het reactieproduct bestudeerd (Figuur 4). De figuur toont aan dat de absorptie van het reactieproduct snel verbetert met de toename van de hoeveelheid bufferoplossing en maximaal wordt wanneer de hoeveelheid bufferoplossing 1,5 mL bereikt. Daarom werd de hoeveelheid van 1,5 mL bufferoplossing gekozen om de hoogste absorptie te garanderen.

Effect van NBD-Cl-concentratie

het onderzoek naar het effect van NBD-CL-concentraties toonde aan dat de reactie afhankelijk was van de reagensconcentratie. De hoogste absorptieintensiteit werd bereikt bij een NBD-Cl-concentratie van 0,2% (w / v) en een hogere concentratie van NBD-Cl leidt tot een afname van de absorptie (Figuur 5).

uit de bovenstaande parameters-aanpassingsexperimenten waren de geoptimaliseerde voorwaarden die voor de assay werden gebruikt: pH 10,5, NBD-Cl-concentratie 0,2% (g/v), volume van de buffer 1,5 mL, reactietijd 25min en temperatuur 25ºC.

Figuur 4: Effect van Bufferhoeveelheid (ml) op de reactie van Thiamine met NBD-Cl.Thiamine (20µg / ml): 1 ml, Buffer pH: 10,5, NBD-CL conc. 0,2% (w / v), reactietijd 25 min.

Figuur 5: Effect van NBD-Cl concentratie op zijn reactie met Thiamine.Thiamine (20µg / ml): 1 ml, Buffer (pH 10,5): 1,5 ml, reactietijd 25 min.

validatie van de methode

De methode werd gevalideerd voor de volgende parameters: specificiteit, lineariteit, precisie, nauwkeurigheid, detectielimiet (LOD), kwantificatielimiet (LOQ) en robuustheid volgens de richtlijnen van de Internationale Conferentie voor Harmonisatie (ICH).

lineariteit, detectielimiet (LOD) bepaalbaarheidsgrens (LOQ)

de lineariteit werd geëvalueerd door middel van een lineaire regressieanalyse, bepaald door zeven thiamineconcentraties te construeren, in het bereik van 05–35µg/mL, die werd berekend met de least square regressiemethode om de kalibratievergelijking en de correlatiecoëfficiënt te berekenen. De kalibratiekrommen werden geconstrueerd door het plotten van concentratie versus absorptie, met behulp van lineaire regressieanalyse. De regressievergelijking voor de resultaten was a = 0,033 x-0,009 (r2 = 0,999), waarbij A de absorptie is bij 434 nm, x de concentratie thiamine in µg/mL in het bereik van 05-35 µg/mL, en r de correlatiecoëfficiënt is (Tabel 1). Er werd vastgesteld dat het lineaire concentratiebereik vergelijkbaar is met onze vorige methode met NQS . De aantoonbaarheidsgrens (LOD) en de bepaalbaarheidsgrens (LOQ) werden bepaald volgens de volgende formule LOD=3.3×SDa / b, en LOQ = 10×SDa / b, SDa is de standaardafwijking van het intercept; b is de helling volgens de ICH-richtlijnen . De LOD en LOQ bleken respectievelijk 0,667 en 2,020 µg/mL te zijn (Tabel 1).

nauwkeurigheid

de nauwkeurigheid van de voorgestelde methode werd uitgevoerd door 3 verschillende concentraties 10, 20 en 30 µg/mL thiaminegeneesmiddel toe te passen binnen een lineair bereik, berekend als het percentage van het geneesmiddel dat uit de monsters werd teruggevonden (Tabel 2).

relatieve fout (RE) was binnen 0,24% met overeenkomstige standaardafwijking binnen 0,004 voor drie verschillende bepalingen (Tabel 3).

robuustheid

reactiemechanisme: er is gemeld dat NBD-Cl reageert met aminogroep van primaire of secundaire aminederivaten . Op dezelfde manier kan de aminogroep van thiamine als nucleofiel werken door het eenzame paar elektronen op het stikstofatoom, trending om het centrum met elektronendeficiëntie in NBD–Cl aan te vallen (Tabel 4 & Figuur 6). Tegelijkertijd is bewezen dat de samenstelling van het product 1:1 thiamine en NBD-Cl is (Figuur 7). Zo wordt geconcludeerd dat aminogroep thiamine met NBD-Cl reageert om een bruin adduct te vormen. De reactievergelijking is weergegeven in Figuur 7.

Figuur 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

toepassing van de voorgestelde methode op de analyse van thiaminedoseringsvorm

Thiaminetabletten werden aan de voorgestelde analyse onderworpen en de claim op het etiket stemt goed overeen met onze nieuwe methode zoals weergegeven in Tabel 5. De voorgestelde methode heeft het voordeel dat het vrijwel vrij is van interferenties door hulpstoffen.

Figure 7: Reactie van Thiamine met NBD-Cl met 1:1 stoichiometrie.