Milano ja viisi muuta kaupunkia pitivät pintansa, ja lokakuussa 1238 hän joutui nostattamaan Brescian piirityksen. Samana vuonna Fredrikin luonnollisen pojan Enzion avioliitto Sardinian prinsessan Adelasian kanssa ja enzion nimeäminen Sardinian kuninkaaksi, jossa paavinistuin vaati ylivaltaa, johtivat lopulliseen välirikkoon paavin kanssa. Gregorius IX epäili syvästi Fredrikiä sekä uskonnollisissa että poliittisissa asioissa: Fredrikin oletettiin vitsailleen, että Mooses, Kristus ja Muhammed olivat kolme huijaria, jotka olivat itse joutuneet huijatuiksi, ja poliittisella areenalla paavi pelkäsi, että Paavivaltiot oltaisiin eristämässä ja saartamassa, erityisesti siksi, että Roomaan oli perustettu keisariutta kannattava puolue. Sillä verukkeella, että keisari aikoi ajaa hänet Roomasta, Gregorius julisti Fredrikin kirkonkiroukseen toisen kerran palmusunnuntaina 20.maaliskuuta 1239. Näin alkoi viimeinen vaihe paavinistuimen ja keisarikunnan välisessä jättimäisessä taistelussa; se päättyi keisarin kuolemaan ja hänen talonsa kukistumiseen.

Fredrik torjui kirkonkirouksen useilla tärkeillä manifesteilla, joista suurimman osan sävelsi Pietro della Vigna, keisarillisen kanslian jäsen, jolla oli huomattavia kirjallisia lahjoja. Manifestissa korostettiin, että kardinaalien oli tarkoitus osallistua kirkon johtoon, ja Fredrik yritti jopa herättää solidaarisuutta maallisten ruhtinaiden keskuudessa. Hän kuitenkin myös kiihdytti sotatoimiaan Pohjois-Italiassa. Rahoittaakseen jatkuvasti kasvavaa aseidentarvettaan hän pani alulle keisarillisen Italian perusteellisen hallinnollisen uudelleenjärjestelyn (muun muassa 10 varahallituksen muodostamisen) ja Sisilian kuningaskunnan. Lisäksi hän määräsi väestön tarkan valvonnan. Keski-Italiassa hän ryhtyi hyökkäykseen miehittäen Anconan marssin ja Spoleton herttuakunnan, ja helmikuussa 1240 hänen armeijansa marssi Paavivaltioihin ja uhkasi Roomaa. Viime hetkellä paavi sai kuitenkin roomalaisten tuen.

sen jälkeen kun Genovalainen laivasto oli lyöty tuomalla edustajia paavin kirkolliskokoukseen Roomaan, yli 100 korkea-arvoista kirkollista—muun muassa kardinaaleja ja piispoja—vietiin Fredrikin vangeiksi Apuliaan. Tämä sotilaallinen voitto osoittautui kuitenkin poliittiseksi haitaksi: se tarjosi aineistoa propagandaan, jossa Fredrik kuvattiin kirkon sortajana.

vielä ennen Roomaa leiriytyneenä Fredrik sai tiedon paavi Gregoriuksen kuolemasta ja vetäytyi sen jälkeen Sisiliaan. Sillä välin mongolit olivat hyökänneet Eurooppaan. Heidät pysäytettiin väliaikaisesti Sleesiassa 9.huhtikuuta 1241 käydyssä äärimmäisen verisessä Liegnitzin taistelussa, mutta luultavasti vain heidän johtajansa, suurkaani Ögödein äkillinen kuolema esti mongolien etenemisen.

Celestinus IV: n lyhyttä pontifikaattia seurasi pitkä interregnum. Kun Innocentius IV valittiin vuonna 1243, Fredrik aloitti Saksan ruhtinaiden ja Ranskan kuninkaan Ludvig IX: n kehotuksesta neuvottelut uuden paavin kanssa. Paavin ja keisarin välinen sopu näytti olevan lähellä paavin valtioiden evakuointia, kun kesäkuussa 1244 Innocentius pakeni kaupungista. Lyonissa hän kutsui koolle kirkolliskokouksen 1245 ja saman vuoden heinäkuussa syöksi keisarin vallasta, ja sovinnon esteenä oli ilmeisesti Lombardin kommuunien asema.

taistelu keisarin ja paavinistuimen välillä raivosi silloin täydessä raivossa. Paavin puolella keisari leimattiin Antikristuksen edeltäjäksi, keisarillisella puolella häntä tervehdittiin Messiaana. Keisari tuki aikalaista vaatimusta kirkon paluusta varhaiskristillisen yhteisön köyhyyteen ja pyhimyksiin ja vetosi jälleen Euroopan ruhtinaisiin, jotta nämä liittyisivät puolustusliittoon vallanhimoisia prelaatteja vastaan. Suurin osa ruhtinaista pysyi kuitenkin puolueettomina, ja vaikka kaksi perättäistä Saksan antikingiä saivat vain vähän kannatusta, keisari menetti tasaisesti asemiaan Saksassa.

toukokuussa 1247 Fredrikin suunnittelema matka Lyoniin oman asiansa puolesta paavin neuvoston edessä keskeytyi strategisesti sijoitetun Parman kaupungin kapinaan. Tämän fiaskon seurauksena suuri osa Keski-Italiasta ja Romagna menetettiin. Seuraavana vuonna keisarin oli määrä kärsiä lisää kohtalon iskuja; Pietro della Vigna, joka oli vuosia keisarin uskottu, syytettiin maanpetoksesta ja hän teki itsemurhan vankilassa. Toukokuussa 1249 Sardinian kuningas Enzio, Fredrikin suosikkipoika, joutui bolognalaisten vangiksi ja häntä pidettiin vangittuna kuolemaansa 1272 saakka.

keisarin asema sekä Italiassa että—poikansa Conrad IV: n ponnistelujen ansiosta—Saksassa oli paranemassa, kun hän kuoli yllättäen vuonna 1250. Hänet haudattiin Palermon katedraaliin lähelle ensimmäistä vaimoaan, vanhempiaan ja Normannilaista isoisäänsä.

kun uutinen hänen kuolemastaan julkaistiin, koko Eurooppa järkyttyi syvästi. Heräsi epäilyksiä siitä, että hän oli todella kuollut; vääriä Frederickejä ilmestyi kaikkialle; Sisiliassa kasvoi legenda, että hänet oli viety Aetna-tulivuorelle; Saksassa, että hänet oli koteloitu vuoreen ja että hän palaisi myöhempien aikojen keisarina rankaisemaan maailmallista kirkkoa ja rauhanomaisesti perustamaan uudelleen Pyhän saksalais-roomalaisen keisarikunnan. Silti hänen ajateltiin elävän myös perillisissään. Itse asiassa he kaikki olivat kuitenkin kuolleet 22 vuoden kuluessa hänen kuolemastaan: heidän isänsä aloittaman paaviutta vastaan käydyn taistelun uhreja.