yhden säteen skannausspektrofotometri

laitteita on kaksi pääluokkaa: yksi säde ja kaksinkertainen säde. Kahden säteen spektrofotometrillä verrataan valon voimakkuutta kahden valoradan välillä, joista toinen polku sisältää vertailunäytteen ja toinen testinäytteen. Yksisäteinen Spektrofotometri mittaa säteen suhteellista valovoimaa ennen testinäytteen lisäämistä ja sen jälkeen. Vaikka kaksipalkkisten mittareiden vertailumittaukset ovat helpompia ja vakaampia, yksipalkkaisilla mittareilla voi olla suurempi dynaaminen alue ja ne ovat optisesti yksinkertaisempia ja kompaktimpia. Lisäksi jotkin erikoisinstrumentit, kuten mikroskoopeille tai teleskoopeille rakennetut spektrofotometrit, ovat käytännöllisyyden vuoksi yksisäteisiä instrumentteja.

historiallisesti spektrofotometrit käyttävät analyyttisen spektrin tuottamiseen monokromaattoria, joka sisältää diffraktioritilän. Ritilä voi olla joko liikuteltava tai kiinteä. Jos käytetään yhtä ilmaisinta, kuten fotomonistinputkea tai fotodiodia, ritilä voidaan skannata vaiheittain (skannausspektrofotometri) niin, että ilmaisin voi mitata valon voimakkuuden kullakin aallonpituudella (joka vastaa jokaista ”askelta”). Myös ilmaisinryhmiä (array spectrofotometer), kuten charge coupled devices (CCD) tai photodiode arrays (PDA), voidaan käyttää. Tällaisissa järjestelmissä ritilä on kiinteä ja kunkin valon aallonpituuden voimakkuus mitataan eri ilmaisimella array. Lisäksi useimmat nykyaikaiset Lähi-infrapunaspektrofotometrit käyttävät Fourier-muunnostekniikkaa spektriinformaation hankkimiseen. Tätä tekniikkaa kutsutaan Fourier-muunnoksen infrapunaspektroskopiaksi.

lähetysmittauksia tehtäessä Spektrofotometri vertaa kvantitatiivisesti valon osuutta, joka kulkee vertailuliuoksen ja testiliuoksen läpi, vertaa sitten sähköisesti kahden signaalin voimakkuuksia ja laskee näytteen läpäisyprosentin vertailustandardiin verrattuna. Heijastusmittauksia varten spektrofotometrillä verrataan kvantitatiivisesti vertailu-ja testinäytteistä heijastuvaa valon osuutta. Lähdelampusta tuleva valo kulkee monokromaattorin läpi, joka diffraktoi valon aallonpituuksien ”sateenkaareksi” pyörivän prisman läpi ja tuottaa tämän diffraktoidun spektrin kapeita kaistanleveyksiä monokromaattorin ulostulopuolella olevan mekaanisen raon kautta. Nämä kaistanleveydet välittyvät testinäytteen kautta. Tämän jälkeen lähetetyn tai heijastuneen valon fotonivuon tiheys (yleensä watteina neliötä kohti) mitataan fotodiodilla, varaukseen kytketyllä laitteella tai muulla valoanturilla. Tämän jälkeen testinäytteen kunkin aallonpituuden läpäisy-tai heijastusarvoa verrataan vertailunäytteen läpäisy-tai heijastusarvoihin. Useimmat mittalaitteet soveltavat lineaariseen läpäisevyyssuhteeseen logaritmisen funktion näytteen ”absorbanssin” laskemiseksi, arvo, joka on verrannollinen mitattavan kemikaalin ”konsentraatioon”.

lyhyesti sanottuna tapahtumasarja skannaavassa spektrofotometrissä on seuraava:

1. valonlähde loistaa monokromaattoriksi, diffraktoituu sateenkaareksi ja jakautuu kahdeksi säteeksi. Sen jälkeen näyte ja vertailuliuokset skannataan.
2. tapahtuman aallonpituuksien Murtoluvut välittyvät näytteen ja referenssin kautta tai heijastuvat niistä.
3. tuloksena oleva valo osuu fotodetektorilaitteeseen, joka vertaa kahden säteen suhteellista voimakkuutta.
4. elektroniset piirit muuntavat suhteelliset virrat lineaarisiksi siirtoprosenteiksi ja/tai absorbanssi / konsentraatioarvoiksi.

array-spektrofotometrissä järjestys on seuraava:

monet vanhemmat spektrofotometrit on kalibroitava ”nollaus” – menetelmällä.kahden palkin nollavirran tasapainottamiseksi ilmaisimessa. Vertailuaineen transmissio asetetaan lähtöarvoksi (datum), joten kaikkien muiden aineiden transmissio kirjataan suhteessa alkuperäiseen ”nollattuun” aineeseen. Spektrofotometri muuntaa tämän jälkeen välityssuhteen absorbanssiksi eli testinäytteen tiettyjen komponenttien pitoisuudeksi suhteessa alkuperäiseen aineeseen.

Sovellukset biokemistryedit

Spektrofotometria on tärkeä tekniikka, jota käytetään monissa biokemiallisissa kokeissa, joihin liittyy DNA: n, RNA: n ja proteiinin eristäminen, entsyymikinetiikka ja biokemialliset analyysit. Koska näytteitä näissä sovelluksissa ei ole helposti saatavilla suuria määriä, ne soveltuvat erityisen hyvin analysoitavaksi tällä tuhoamattomalla tekniikalla. Lisäksi arvokas näyte voidaan tallentaa käyttämällä mikrotilavuusalustaa, jossa täydellisiin analyyseihin tarvitaan niinkin vähän kuin 1UL näytettä. Lyhyt selitys spektrofotometrian menetelmästä sisältää värillistä yhdistettä sisältämättömän nollanäytteen absorbanssin vertaamisen värillistä yhdistettä sisältävään näytteeseen. Tämä väritys voidaan tehdä joko väriaineella, kuten Coomasie Brilliant Blue g-250, mitattuna 595 nm: ssä, tai β-galaktosidaasin ja onpg: n (muuttaa näytteen keltaiseksi) välisellä entsymaattisella reaktiolla mitattuna 420 nm: ssä.:21-119 spektrofotometrin avulla mitataan värillisiä yhdisteitä näkyvällä valon alueella (350-800 nm),:65 näin voidaan löytää lisää tietoa tutkittavasta aineesta. Biokemiallisissa kokeissa valitaan kemiallinen ja / tai fysikaalinen ominaisuus, ja menetelmä, jota käytetään, on spesifinen kyseiselle ominaisuudelle, jotta saadaan lisää tietoa näytteestä, kuten määrästä, puhtaudesta, entsyymiaktiivisuudesta jne. Spektrofotometriaa voidaan käyttää useissa eri tekniikoissa, kuten näytteiden optimaalisen aallonpituusabsorbanssin määrittämisessä, näytteiden absorbanssin optimaalisen pH: n määrittämisessä, tuntemattomien näytteiden pitoisuuksien määrittämisessä ja eri näytteiden pKa: n määrittämisessä.:21-119 Spektrofotometria on myös hyödyllinen prosessi proteiinin puhdistuksessa ja sitä voidaan käyttää myös menetelmänä yhdisteen optisten määritysten luomiseen. Spektrofotometrisiä tietoja voidaan käyttää myös Beer-Lambertin yhtälön yhteydessä, A = − log 10 ⁡ T = ϵ C l = O D {\textstyle a=-\log _{10}T=\epsilon cl=OD}

, jotta määritä erilaiset transmittanssin ja keskittymisen väliset suhteet sekä absorbanssi ja keskittyminen.:21-119 koska Spektrofotometri mittaa yhdisteen aallonpituutta sen värin kautta, siihen voidaan lisätä väriainetta sitovaa ainetta, jotta se voi käydä läpi värimuutoksen ja se voidaan mitata. Kahden komponentin seoksen pitoisuudet on mahdollista tietää kunkin komponentin standardiliuosten absorptiospektrien avulla. Tätä varten on tarpeen tietää tämän seoksen ekstinktiokerroin kahdella aaltopituudella ja liuosten ekstinktiokertoimet, jotka sisältävät näiden kahden komponentin tunnetut painot. Spektrofotometrejä on kehitetty ja parannettu vuosikymmenten aikana, ja niitä on käytetty laajalti kemistien keskuudessa. Lisäksi Spektrofotometrit ovat erikoistuneet mittaamaan joko UV-tai näkyvän valon aallonpituuden absorbanssiarvoja.:21-119 sitä pidetään erittäin tarkkana välineenä, joka on myös hyvin herkkä ja siksi erittäin tarkka erityisesti värimuutoksen määrittämisessä. Tämä menetelmä on myös kätevä käyttää laboratoriokokeissa, koska se on edullinen ja suhteellisen yksinkertainen prosessi.