liikkuva faasi

käänteisfaasikromatografiassa liikkuva faasi on veden tai puskurin seos polaarisen orgaanisen liuottimen, kuten metanolin, asetonitriilin, isopropanolin (IPA) tai tetrahydrofuraanin (THF) kanssa. Eluutiovahvuus kasvaa suurin piirtein tässä järjestyksessä. Alkoholit ovat protonin luovuttajia, kun taas asetonitriili on protonin vastaanottaja. Asetonitriilin ja veden seoksilla on pienempi viskositeetti kuin muiden liuottimien seoksilla veden kanssa. Tämä johtaa alempaan vastapaineeseen. IPA / vesi seoksilla on suurin viskositeetti. Matalammasta viskositeetista johtuvan vastapaineen vuoksi kaksi yleisemmin käytettyä orgaanista liikkuvaa faasia ovat asetonitriili ja metanoli. Myös asetonitriilillä on alhainen imeytyminen alhaisessa UV-säteilyssä, paljon vähemmän kuin muilla liuottimilla.

vesi on käänteisfaasikromatografian heikoin eluentti. Metanolin tai asetonitriilin lisääminen vähentää retentiota. Retentiokertoimen logaritmi pienenee suurin piirtein suhteessa orgaanisen liuottimen pitoisuuteen. Jos tutkittavana oleva aine on pieni molekyyli kuten useimmilla lääkeaineilla, retentio vähenee karkeasti seitsenkertaiseksi, kun metanolin pitoisuus liikkuvassa faasissa kasvaa noin 20%. Monissa olosuhteissa (esimerkiksi menetelmän kehityksessä) oletetaan, että retentiokertoimen logaritmin ja orgaanisen modifioijan tilavuusosuuden välillä on lineaarinen suhde liikkuvassa faasissa. Tätä on kuitenkin pidettävä vain hyvänä nyrkkisääntönä, joka ei ole tarkka eikä teoreettisesti perusteltu.

johtuen asetonitriilin solvausominaisuuksista metanoliin verrattuna toisen liuottimen korvaaminen toisella johtaa usein analyyttien eluutiojärjestyksen muuttumiseen (kuva 2). Siksi tätä tekniikkaa käytetään usein menetelmän kehittämisessä. Muutos yhdestä modifioijasta toiseen aiheuttaa merkittävämpiä selektiivisyysmuutoksia kuin pelkkä liuottimen vahvuuden muutos (eli muuttamalla yksinkertaisesti orgaanisen liuottimen pitoisuutta). THF muuttaa myös valikoivuutta rajusti. Itse asiassa suurimmat selektiivisyysmuutokset johtuvat usein jonkin metanolin tai asetonitriilin korvaamisesta THF: llä. Useista syistä, kuten sen epämiellyttävästä hajusta, peroksidien muodostumisesta ja epäedullisesta UV-läpinäkyvyydestä, sitä ei kuitenkaan käytetä kovin usein.

kuva 2. Liikkuvan faasin muuntajan vaikutus erotuksen selektiivisyyteen. Ylhäällä asetonitriili, alhaalla metanoli. Sarake: XTerra RP18, 4,6 mm×50 mm, 3,5 µm. Gradientti 2 ml min-1 Yli 15 min 0-80% orgaanista PH 3: ssa ammoniumformiaatin kanssa. Analyyttejä: 1, triamtereeni; 2, klortalidoni; 3, althiatsidi; 4, furosemidi; 5, bentstiatsidi; 6, probenesidi; 7, etakryynihappo; 8, bumetanidi; 9, kanreenihappo. (Kromatogrammi: Diane Diehl ja Kim Tran, Waters Corporation.)

liuottimen selektiivisyyden tulkintaa hankaloittaa se, että stationäärifaasin ligandit adsorboivat orgaanista liuotinta ja sen voidaan katsoa kuuluvan stationäärifaasiin. Viime aikoina useat kirjoittajat ovat mitanneet orgaanisten modifioijien pintaylimäärän standardin C18-tyypin stationäärifaasien osalta ja löytäneet merkittäviä eroja asetonitriilin ja metanolin pintajohdossa.

tämän jakson alussa mainittiin, että metanolin retentio on suurempi kuin asetonitriilin. Tämä on vielä selvempää ionisoituneille yhdisteille kuin ionisoimattomille yhdisteille. Tämä on järkevää siitä näkökulmasta, että adsorboitunut metanoli stationäärifaasissa helpottaa ionisoituneiden molekyylien tunkeutumista stationäärifaasiin. Sama kuvio löytyy, kun metanolia verrataan THF: ään. Nämä ovat hyödyllisiä ominaisuuksia menetelmien kehittämisessä. Toisaalta sulfonamidin funktionaalisten ryhmien yhdisteillä THF: ssä on suhteellisesti enemmän retentiota verrattuna vertailuanalyyttiryhmään. Kaiken kaikkiaan orgaanisen liuottimen merkittävä vaikutus erotuksen selektiivisyyteen on havaittavissa, mutta järkeistäminen on vaikeaa, koska liuotin löytyy sekä stationaarisesta että liikkuvasta faasista. Jotkut kirjoittajat ovat myös yrittäneet erottaa korkean vesipitoisuuden liikkuvia faaseja matalasta vesipitoisuudesta.

kuten edellä mainittiin, eri liuottimien väliset tärkeät selektiivisyyserot ovat erittäin hyödyllinen väline käänteisfaasierotusten kehittämisessä. Klassisen menetelmän kehitysohjelmissa on käytetty metanolia, asetonitriiliä ja THF: ää liikkuvassa faasissa orgaanisina muuntajina. Välivaiheen selektiivisyydet saadaan liuotinseoksilla, ja piikkivälin säätö onnistuu vaivatta. Nykyaikaiset menetelmäkehitysohjelmat käyttävät lämpötilaa toisena helposti hallittavana muuttujana selektiivisyyden säätämisessä.

tärkeä osa liikkuvan faasin selektiivisyyttä on sen pH. ionisoituvien yhdisteiden pidättymisen valvonta puskureiden tai hapon tai emäslisäaineiden avulla liikkuvaan faasiin on erittäin tärkeää. Valitsemalla järkevästi liikkuvan vaiheen pH: n voidaan helpottaa retention ja selektiivisyyden manipulointia. Kuten edellä mainittiin, ero säilyvyys ionisoituneen ja ionisoimattoman muodon analyytin välillä voi olla 10 – 30-kertainen, ja pH: n säätely on tärkeää.

viime vuosina tutkimukset ovat osoittaneet, että sekä puskurin pH-että ionisaatiovakiot muuttuvat, kun siihen lisätään orgaanisia liuottimia. Tällä on merkittäviä vaikutuksia säilyttämisen valvontaan. Yleensä voidaan päästä tutkittavan aineen määriteltyyn ionisaatioon, jos liikkuvan faasin pH on ±2 pH-yksikön päässä tutkittavan aineen pKa: sta. Mutta jos sekä pH että analyyttinen pKa muuttuvat orgaanisen liuottimen lisäämisen myötä, tätä ei ole helppo käsitellä yksinkertaisilla säännöillä. Siksi hyvä pH-kontrolli ja hyvä puskuri ovat tärkeitä elementtejä ionisoituvien analyyttien käänteisfaasierotuksen toistettavuudessa. PH mitataan vedestä, jossa tunnetaan yleisesti käytettyjen puskureiden pKa-arvot ja pysytään mieluummin lähellä näitä pKa-arvoja. Suurin puskurikapasiteetti löytyy puskurin pKa: sta. Vaikka pH muuttuu orgaanisen liuottimen läsnä ollessa, puskurikapasiteetti ei muutu. Käänteisfaasikromatografian harjoittajalle tämä on tärkeä osa retentiokontrollia. Toisaalta käänteisfaasiretentiomekanismien tutkijan on oltava valmis mittaamaan pH orgaanisen liuottimen läsnä ollessa, jotta hän ymmärtää täysin sen vaikutuksen retentioon. Tyypillisesti orgaanisen liuottimen lisääminen johtaa happojen pKa: n nousuun ja emästen pKa: n vähenemiseen. Tämä koskee sekä puskureita että analyyttejä. Tämä voi johtaa tutkittavan aineen odotetun ionisaatiomallin merkittävään muuttumiseen. Tässä on esimerkki, joka valaisee tätä: amiini, jonka pKa on 9, ionisoituu täysin fosfaattipuskurissa veden pH 7: ssä, mutta se voi olla vain puoliksi ionisoitunut samassa puskurissa 70-prosenttisen metanolin lisäämisen jälkeen. On selvää, että tällaiset vaikutukset ovat merkittäviä. Siksi tarkka tapa valmistaa puskuri ja säädellä sen pH: ta on erittäin tärkeä ionisoituvien analyyttien käänteisfaasiretention hyvän hallinnan kannalta.

muut ioniset interaktiot vaikuttavat myös ionisoituneiden analyyttien käänteisfaasierotuksen retentioon ja selektiivisyyteen. Klassinen työkalu ionianalyysien retention lisäämiseksi on ioniparikromatografia. Tässä tekniikassa stationäärifaasi tasapainotetaan hydrofobisella varautuneella ionilla, kuten pitkäketjuisella sulfonihappo-ionilla (esimerkiksi oktyylisulfonaatti) tai hydrofobisella kvaternaarisella amiinilla (esimerkiksi tetrabutyyliammoniumioni). Tyypillinen liikkuvafaasikonsentraatio on noin 10 mM. ioniparireagenssin lisääminen liikkuvaan faasiin Lisää kohde-ionien retentiota, vähentää ioniparireagenssin kanssa saman varauksen omaavien ionien retentiota ja jättää neutraalien analyyttien, kuten zwitterionien, retention lähes muuttumattomaksi. Näin ollen se on erinomainen työkalu säätää erotuksen valikoivuutta. Selektiivisyyden muutokset johtuvat siitä, että ioniparireagenssi adsorboituu stationäärifaasin pinnalle. Yksinkertaisin tulkinta tuloksena olevasta retentiomekanismista on ioninvaihdon ja käänteisfaasimekanismin yhdistelmä. Kun ionipari-reagenssin pitoisuus liikkuvassa faasissa kasvaa, vastakkaisesti varautuneiden analyyttien retentio kasvaa aluksi ja tasaantuu sitten suuremmilla pitoisuuksilla. Ioniparireagensseilla, joiden ketjupituus on erilainen, retentio kasvaa nopeammin pidemmällä ketjupituudella.

toinen kationisilla analyyteillä tavattu ioni-vuorovaikutusvaikutus on retention lisääntyminen, kun liikkuvaan faasiin lisätään pieniä epäorgaanisia vasta-ioneja. Vaaditut pitoisuudet ovat tyypillisesti noin 10-kertaisia ioniparireagenssien kanssa käytettäviin pitoisuuksiin verrattuna. Tyypillisiä tämän tyyppisiä anioneja ovat perkloraatti (ClO4−), tetrafluoriboraatti (BF4−) tai heksafluorifosfaatti (PF6−). Ne lisäävät kationisten analyyttien säilymistä merkittävästi. Vaikutus on voimakkaampi asetonitriilillä liikkuvan faasin lisäaineena kuin metanolilla. Tämä selittyy stationäärifaasissa adsorboituneella paksummalla asetonitriilikerroksella verrattuna monomolekyyliseen metanolikerrokseen ja vasta-ionin jakautumisella tähän kerrokseen. Käyttäjien näkökulmasta kationianalyysien retentiokäyttäytyminen näiden epäorgaanisten anionien läsnä ollessa ei ole erilainen kuin todellisilla ioniparireagensseilla eli pitkäketjuisilla sulfonihapoilla havaittu.