ACsN-algoritminen viitekehys

ACsN yhdistää kameran kalibroinnin, melun estimoinnin ja harvan suodatuksen korjaamaan tärkeimmät sCMOS-kameran tuottamat melulähteet (Kuva. 1a ja Lisähuomautukset 1 ja 2.1). Erityisesti ACsN korjaa ensin kiinteän kuvion kohinan käyttämällä sCMOS-pikselien offset-ja vahvistuskarttaa. Kiinteäkuvioisen kohinan esiintyminen sCMOS-kameroissa tuottaa eri pikseleinä (p) eri määrän fotoelektroneja kuin saman määrän impingoivia fotoneja (sp). Tämä vaikutus on verrannollinen valaistustasoon, ja se voidaan mallintaa Poisson-hajautetun muuttujan SP parametrille sovellettuna kertovana tekijänä yp. Samaan aikaan analogisesta digitaaliseen (AD) muunnoksen aikana jokaisen pikselin tuottama jännite luetaan erotukseksi vertailutasosta, joka kuvaa valon puuttumista. Käytännössä tälle viitejännitteelle annetaan positiivinen arvo, joka vastaa bias (ßp) mitatuissa intensiteettiarvoissa. Siksi sCMOS-kameran hankintaa voidaan mallintaa yhtälöllä:20

missä ZP on pikselin p arvo, τ valotusaika, ja N (0, σr) Gaussin hajautetun lukuhälyn keskiarvo Μr = 0 ja keskihajonta ΣR. Kun otetaan huomioon fluoresenssimikroskopian käytännöllisyys, tässä mallissa on jätetty pois pimeän virran osuus, jota ei voida ottaa huomioon alle 1 s: n altistusajoissa, ja ad-muuntamisen aiheuttama kvantisointimelu, joka on vähäpätöinen verrattuna lukema noise3,21: een (lisähuomautus 2.2).

a Concept of the ACsN algorithm. Tulokuva skaalataan kameran pikselivoitto-ja offsetkarttojen avulla kiinteän kuvion kohinan (FP) poistamiseksi. Tämän jälkeen kokeellisten parametrien avulla lasketaan OTF-raja ja tuotetaan ylipäästösuodatettu kuva, josta saadaan kohinan estimaatti (ne). Lopuksi suoritetaan sparse filtering (SF) denoisoidun kuvan luomiseksi. B Kohinavaihtelujen vertailu ennen (harmaat ruudut) ja jälkeen (punaiset ympyrät) kohinakorjauksen. Kaikki tiedot jaettiin puhtaan Poisson-kohinan odotusarvolla. Dashed line edustaa ihanteellinen kameran suorituskykyä. Tämän juonen tuottamiseksi käytettiin kolmea eri kuvasarjaa HeLa mikrotubuleista. Virhepalkit edustavat ajallista keskihajontaa (STD), jota arvioidaan yli 100 kuvan verran. c, d Vaihtelukartat eli STD arvioi yli 100 sCMOS-kuvaa, jotka on hankittu 10 ms: n valotusajalla ennen (c) ja jälkeen (d) ACsN-denooinnin. Intensiteetit ilmoitetaan analogisista digitaalisiin yksiköihin (Adu). E, f zoomattu-kuvia alueilla merkitty valkoiset neliöt C ja d, vastaavasti. g E: n ja f: n ympyröityjä alueita (1 ja 2) vastaavien pikselien intensiteettiarvojen ajallinen vaihtelu. Alkuperäisen ja denooidun kuvan arvot on piirretty harmaalla ja punaisella. Vaa ’ at: 500 nm (a), 1 µm (b), 3 µm (d), 300 nm (f).

koska kiinteän kuvion kohina riippuu vain kameran piiristä, ßp ja yp voidaan arvioida kertaluonteisella kalibroinnilla (KS.menetelmät). Sekä Gaussin jakaman lukukohinan N(0, σR) että Poissonin jakaman fotonilaukauksen kohinan Pois{SP(τ)} aiheuttama vaihtelu on kuitenkin arvioitava huolellisesti, jotta saadaan tarkka arvio taustalla olevasta signaalista Sp. Tätä arviointia varten kehitimme melumallin, joka mahdollistaa kohinavarianssin yhteisen arvioinnin analysoimalla mikroskopiajärjestelmän taajuusvastetta. Tämä perustuu siihen, että fotonilaukauksen kohinan Poisson-jakauma voidaan approksimoida Gaussin jakaumalla, kun fotonivuo on >3 fotonia per pikseli22. Erityisesti Poisson-varianssin, \(\sigma _P^2\), ja Gaussin varianssin, \(\sigma _G^2\), approksimoimalla aikaansaatu virhe tulee <1%, kun fotonivuo on yli 5 fotonia pikseliä kohti (lisähuomautus 2.3). Erityisesti edellä mainitut fotonivuon ehdot täyttyvät yleensä monissa fluoresenssimikroskopian käyttökohteissa 23, 24. Siksi pidämme kameraan liittyvää kohinaa kahden riippumattoman Gaussin jakaman satunnaismuuttujan summana,jonka varianssi on \(\sigma _N^2 = \sigma _R^2 + \sigma _G^2\). Tällainen jakauma koostuu vakiotehospektritiheydestä, kun taas näytteestä tulevat signaalit sisältyvät optiseen siirtofunktioon (OTF) 25. Siksi hyödynnämme optisen järjestelmän tuntemusta arvioidaksemme pikselin vaihtelua OTF: n ulkopuolella, mikä johtuu vain kohinasta, ja sitten käytämme saatua arvoa σN: n johtamiseen alkuperäiseen kuvaan (lisähuomautus 2.3).

seuraavaksi algoritmi käyttää näitä kohinatilastoja ei-paikalliseen näytteen samankaltaisuuden arviointiin ja yhteistoiminnalliseen harvakseltaan suodattamiseen tulosekvenssissä. Toisin kuin aiemmat yhteistoiminnallisen suodatuksen toteutukset, otimme käyttöön kerroksellisen lähestymistavan, joka mittaa peräkkäin kuvan samankaltaisuuden tilassa ja ajassa kohinan korjaamisen parantamiseksi tinkimättä tarkkuudesta ja ajonajasta. Lyhyesti, suodatin hajottaa kuvan laastareina ja lajittelee ne kolmiulotteisiin (3D) ryhmiin niiden samankaltaisuuden mukaan26. Sitten, se työllistää 3D-muunnos käsitellä kunkin ryhmän kaikki kerralla. Denoointi suoritetaan kovalla thresholdingilla ja sitä tehostaa se, että laikkujen samankaltaisuuden vuoksi 3D-muunnos johtaa alkuperäisten laikkujen vieläkin harvempaan esitykseen, kun taas kohinan tehospektri pysyy vakiona 27. Tämän jälkeen denooidut laikut palautetaan alkuperäisille paikoilleen välikuvaksi. Tässä vaiheessa yhteistoiminnallinen suodatin ajetaan toisen kerran, mutta se korvataan kovassa käytössä olevalla Nakkisuodattimella. Suodatin suoritetaan käyttäen sekä äänikuvia että välikuvia, ja se tuottaa lopullisen denoisoidun kuvan (lisähuomautus 2.4). On huomattava, että kohinan alueellinen vaihtelu eri puolilla kuvaa voi vaikuttaa Nakkisuodattimen suorituskykyyn. Tätä kuitenkin lieventää huomattavasti laastaripohjainen käsittely, joka koko kuvaan verrattuna parantaa yksittäisten paikkaryhmien intensiteetin tasaisuutta ja on erittäin stabiili spatiaalisesti muunneltua noise9: ää vastaan.

lopuksi suoritetaan toinen yhteistoiminnallinen suodatin, joka etsii samanlaisia laastareita myös naapurikehyksiin. Tällä tavoin viipyilevää melua voidaan edelleen vähentää hyödyntämällä näytteen itsensä samankaltaisuutta ajassa säilyttäen ajallinen resoluutio18 (lisähuomautus 2.5).

Acsn: n Luonnehdinta

seuraavaksi luonnehdimme acsn: n suorituskykyä sekä numeeristen että kokeellisten tietojen avulla. Erityisesti acsn-yhteistoiminnallinen suodatus riippuu σN: n estimoinnista sekä algorithm28: n parametrien valinnasta, jotka valittiin sekä kohinan korjauksen että ajonajan optimoimiseksi (lisähuomautus 3.1). Havaitsimme, että strategiamme voi merkittävästi vaimentaa kameramelun haitallista vaikutusta välttäen kuvan resoluution häviämisen, erityisesti jos kyseessä on erittäin avaruudellinen kohina (lisähuomautus 3.2). Lisäksi kameran kohina voi aiheuttaa pikseliarvojen ajallisia vaihteluita, jotka eivät liity otokseen, vaikuttaen näin aikahälytystietojen kvantitatiiviseen analyysiin. ACsN denoising vähentää tätä vaikutusta noin yhden suuruusluokan, jäännösvaihtelut verrattavissa ihanteellinen kamera (kuva. 1b-g ja lisähuomautus 3.3). Lisäksi on huomattava, että matalilla fotonimäärillä näytteen yksityiskohdat alkavat olla vertailukelpoisia kohinavaihteluiden kanssa ja muuttuvat vaikeammiksi hakea. Näin ollen kuvan restauroinnin suorituskyky liittyy olennaisesti tulokuvan fotonivuotoon. Tästä huolimatta, käyttäen sekä simulaatioita että kokeellisia tietoja, varmistimme vahvan ACsN-kohinakorjauksen heikossa valaistuksessa, jopa 5-10 fotonia pikseliä kohti (lisähuomautus 3.4).

lisäksi validoimme ACsN: n suorituskyvyn erilaisilla näytteenottotiheyksillä, joita tavallisesti käytetään fluoresenssimikroskopiassa. Käytännössä Nyquist-kriteeriä lähellä oleva näytteenottotaajuus merkitsee hyvää vaihtokauppaa signaali-kohina-suhteen (SNR) ja yksityiskohtien säilyttämisen välillä. Tutkittaessa numeerisesti ja kokeellisesti laajalla näytteenottotaajuudella osoitimme acsn: n elinkelpoisuuden alhaisen SNR: n osalta ylinäytteellä eikä havaittavaa signaalien menetystä Ali-näytteenotolla (lisähuomautus 3.5).

toisin kuin luonnonkuvat, biologisten näytteiden fluoresoivat kuvat ovat tarkasti määriteltyjä, ja niissä on tarkasti merkittyjä molekyylikohteita tai-rakenteita soluissa. Siksi jokaisessa loisteputkikuvassa on yleensä eri näkökentässä toistuvia kohteita, mikä antaa riittävästi ei-paikallista samankaltaisuutta, jotta algoritmi olisi erityisen tehokas fluoresenssimikroskopiassa. Numeerisilla ja kokeellisilla tiedoilla luonnehdimme acsn-suorituskyvyn riippuvuutta syöttökuvan itsensä samankaltaisuuden käytöstä (lisähuomautus 3.6). Lisäksi, kuten seuraavassa osoitetaan, arvioimme kvantitatiivisesti erilaisia ei-biologisia ja biologisia näytteitä todentaaksemme menetelmän elinkelpoisuuden, kattaen eri ulottuvuudet, morfologian, satunnaisuuden ja tiheyden, kuten kaliiperin kohteet, fluoresoivat hiukkaset, yksittäiset molekyylit, Mikrotubulukset, aktiinifilamentit, mitokondriot, filopodia, lamellipodia ja pienet eläimet.

Laajakenttämikroskopia

Laajakenttämikroskopia, erityisesti sisäinen kokonaisheijastusfluoresenssi (TIRF-mikroskopia), on yksi laajimmin käytetyistä tekniikoista29. TIRF käyttää ilmiötä koko sisäinen heijastus valon lasi / vesi rajapinta luodakseen evanescent aalto, joka etenee vain muutaman sadan nanometrin koko coverslip. Tämä mahdollistaa näytteen alaosassa olevien fluoresoivien nimilappujen selektiivisen magnetoinnin (täydentävä Kuva. 1 A). Kuitenkin heikkojen loisteputkilähettimien, heikon valon voimakkuuden tai lyhyen valotusajan tapauksessa sCMOS: ään liittyvä melu muuttuu vakavaksi ja huononee kuvanlaatua (täydentävä Kuva. 1b). ACsN denoising voi tehokkaasti vähentää tällaista panosta ja palauttaa vääristymättömät signaalit kohinasta, mikä mahdollistaa nopeamman hankinnan vaarantamatta taustalla olevaa signaalia (täydentävä Kuva. 1c, d).

osoitimme laajakenttämikroskopian denooinnin sekä epi-fluoresenssi-että TIRF-konfiguraatioissa käyttämällä erilaisia kiinteitä, eläviä ja monivärisiä solunäytteitä, mukaan lukien Mikrotubulukset (Kuva. 1 ja täydentävä Kuva. 1), mitokondriot (Kuva. 2 ja täydentävät Elokuvat 1 ja 2), ja F-aktin (Kuva. 2). ACsN: n käyttö voi säilyttää saman kuvanlaadun lyhyemmällä valotusajalla (eli paremmalla ajallisella resoluutiolla) ja pienemmällä herätetasolla (eli pienemmällä kuvavahingolla). Suorituskykyä rajoittaa siis lähinnä loisteputkilähettimien kuvafysiikka. Käyttämällä kvantitatiivisia mittareita osoitimme, että menetelmä voi palauttaa laajakenttäkuvia fotonibudjetilla kaksi suuruusluokkaa pienemmäksi ilman kuvanlaadun menetystä (täydentävä Taulukko 1).

a EPI-fluoresenssikuvantaminen mitokondrioista naudan kiinteissä keuhkovaltimon endoteelisoluissa (BPAE) 1 ms: n altistusajalla B sama kuva A: ssa ACsN-denoinnin jälkeen. C-f Zoomatut kuvat A: n ja b: n vastaavista laatikkoalueista. kvantitatiiviset tulokset ja analyysit on esitetty täydentävässä taulukossa 1. g edustava kehys 100 mitokondriota elävissä ihmisalkion munuais – (hek) soluissa kuvaavasta aikarajasta, joka on mitokondrioita 50 Hz: n taajuudella (valotusaika: 20 ms). h ACsN-käsittelyn jälkeen saatu kuvajärjestyksen (g) vastaava edustava kehys. Pikkukuvat G-ja h-kohdissa on zoomattu-kuvat vastaavista alueista, jotka on merkitty murskattuun valkoiseen ruutuun G. I-n zoomattu – kuvat vastaavista alueista, jotka on merkitty kiinteään keltaiseen ruutuun g: nä eri aikapisteinä 200 ms (i, l), 800 ms (j, m) ja 1200 ms (k, n). o, p kaksivärinen kuva ennen (o) f-aktiinin (syaani) ja mitokondrioiden (oranssi) denoisointia kiinteissä BPAE-soluissa, jotka on saatu TIRF-mikroskopialla 2 ms: n altistusajalla, ja sen jälkeen (p) Acsn. q, r Poikkileikkausintensiteettiprofiilit (o) ja (p) o: n vastaavaa katkoviivaa pitkin, jotka osoittavat huomattavasti denoisoituneita ja paremmin selvitettyjä solurakenteita. Asteikkotangot: 10 µm (b), 3 µm (f), 4 µm (h, p), 1 µm (h, pikkukuva) ja (l).

Dekonvoluutiota ja valokenttämikroskopiaa

Kuvan dekonvoluutiota käytetään laajalti optisessa mikroskopiassa heikkolaatuisten kuvien palauttamisesta superresoluutiotekniikoiden parantamiseen30. Melu voi kuitenkin helposti heikentää monien yleisten algoritmien suorituskykyä tuottamalla dekonvoluutioesineitä. Sen sijaan havaitsimme huomattavaa vähennystä tällaisten artefaktien dekonvolvoitu kuvia käyttämällä ACsN denoising ennen eri menetelmiä perustuu Richardson–Lucy algorithm31, kone learning32, ja radial fluctuation33 (lisähuomautus 4.1). Kuvan restauroinnin tehostuminen näkyy myös globaalin kuvanlaadun paranemisena, jota arvioidaan käyttäen mittareita, kuten Pearsonin kerroin (RSP)34-resoluutiota. Esimerkiksi yhdistämällä acsn ja säteisvaihtelu, saimme aikaan super-resoluutiokuvia, joilla on parempi RSP-arvo ajallisella resoluutiolla, joka on jopa kaksi suuruusluokkaa suurempi kuin tällä hetkellä raportoitu 33 (täydentävä Kuva. 2).

Kuvan dekonvoluutio perustuu myös kolmiulotteiseen rekonstruktioon valokenttämikroskopiassa (LfM). LFM käyttää mikroskopiajärjestelmässä microlens array-järjestelmää, jolla saadaan sekä kaksiulotteinen (2D) tila-että 2D-kulmatieto kohdevalosta, mikä mahdollistaa näytteen koko 3D-tilavuuden laskennallisen rekonstruoinnin yhdestä kameran kehyksestä35. Dekonvoluutioon perustuva rekonstruktio on kuitenkin erittäin herkkä SNR: lle, erityisesti LfM: n laajakenttäisen, volumetrisen ja nopean kuvantamisjärjestelmän vuoksi. Tästä syystä ACsN: n käyttö raw-kuvien kohinan korjaamiseen (Kuva. 3a, b) johtaa selvästi havaittavaan parannukseen 3D-valokentän rekonstruktioissa (Kuva. 3c, d). Melun esiintyminen johtaakin 3D-kohteen virhearvioon tai fluoroforeihin liittymättömien piikkien etenemiseen. Ensin mainittu vaikuttaa näytteenottoon aksiaalisen ulottuvuuden kautta ja voi johtaa epätasaiseen aksiaaliseen erottelukykyyn (Kuva. 3 e, f). Jälkimmäinen tuottaa lisätaustaa, joka peittää fluoresenssisignaalin, heikentäen myös sivusuuntaista erottelukykyä (Fig. 3g-i). Käyttämällä ACsN, molemmat puutteet voidaan lieventää, mikä parantaa huomattavasti 3D volumetrinen renderöinti solurakenteiden.

A, b Raakavalokenttäkuvat Mikrotubuluksista HeLa-solussa ennen (a) ja jälkeen (b) ACsN-käsittelyn. Pikkukuvat näyttävät suurennetut mikrolinssit vastaavista boxed-alueista, joissa melu on huomattavasti vähentynyt, kuten nähdään b.c, d kolmiulotteisissa (3D) rekonstruoiduissa kuvissa, jotka on saatu A: sta ja B: stä. Syvyystiedot koodataan väriasteikon mukaan. Pikkukuvat näyttävät zoomatut kuvat vastaavista valkoisista murskatuista boxed-alueista, joissa parempi kuvanlaatu ja parannettu 3D-resoluutio havaitaan ACsN-denoinnin jälkeen. e, f poikkileikkaukset YZ tasolla vastaavat punainen katkoviivat c ja D, vastaavasti, jossa microtubule rakenteet ovat paremmin ratkaistu pelkistettyjä esineitä käyttäen ACsN. g, h zoomattu-Kuvia punainen kiinteä boxed alueilla c ja d, vastaavasti, Z = 1.4 µm, jossa mikrotubulus rakenteet ovat paremmin ratkaistu käyttämällä ACsN. i Poikkileikkausprofiilit (g, harmaa) ja (H, punainen) vastaavat valkoisia murskattuja viivoja g, h, vastaavasti. Hehkulangat, jotka eivät sisällä fluoriforeihin liittyvää taustamelua, ratkaistaan ACsN: n avulla. Asteikkotangot: 8 µm (b, d), 800 nm (b, pikkukuva), 3 µm (d, pikkukuva), 1 µm (e, g).

Yksimolekyylisen lokalisointimikroskopian

acsn: n toteutettavuuden vahvistamiseksi yksimolekyylisen lokalisointimikroskopian (SMLM)36, teimme HeLa-solujen mitokondrioiden MYRSKYKUVAUKSEN (Supplementary Fig. 3). SCMOS: ään liittyvän kohinan vaikutus yksimolekyylisessä lokalisoinnissa voidaan nähdä kahdella tavalla: väärien negatiivien esiintyminen, joka johtuu kohinan peittämien heikosti emittoivien molekyylien häviämisestä (täydentävä Kuva. 3c, d), ja läsnäolo vääriä positiivisia, koska kuuma pikseliä tai yksinkertaisesti kohinajakauma (täydentävä Kuva. 3 e, f). Kohinan poistaminen yhden molekyylin raakadatasta mahdollistaa molempien lokalisointivirheiden vaimentamisen, mikä parantaa merkittävästi myrskyn kuvanlaatua ja mittareita, kuten RSP ja Resolution Scaled Error (RSE)34 (Fig. 4 A, b). Myös tällainen lokalisoinnin tehostaminen johtaa parempaan kontrastiin ja sellaisten piirteiden ilmaantumiseen, jotka eivät ole selvästi näkyvissä rekonstruktiossa ilman denoisointia (Kuva. 4c-f). Lisäksi näytteeseen liittymättömien pikselivaihtelujen vähentäminen mahdollistaa fluoroforien vilkkumisnopeuden kartan, jota voidaan käyttää epätäydellisen merkinnän vaikutusten lieventämiseen (täydentävä Kuva. 4).

myrskykuva mitokondrioista kiinteässä HeLa-solussa (RSP: 0.81, RSE: 40.6). B MYRSKYKUVA rekonstruoitu sen jälkeen, kun A: n raakamolekyylitiedot on denooitu (RSP: 0.85, RSE: 36.7). Molemmissa tapauksissa käytettiin 5 000 yksimolekyylistä kehystä. Raaka-aineiston edustavatkehykset ennen denoointia ja sen jälkeen esitetään täydentävässä Kuvassa. 3. Kvantitatiivinen kuva-analyysi NanoJ-oravalla arvioi sekä RSP: n ( + 0,04) että RSE: n (-3,9) arvojen parantuneen B: ssä A: han verrattuna. On havaittu, että lokaalisuuden määrä B: ssä kasvaa A: han verrattuna, mikä johtaa parempaan kontrastiin edellisessä ja sellaisten piirteiden ilmaantumiseen, jotka eivät näy jälkimmäisessä (c–f). g fluoresoivan helmen Yksihiukkasseuranta, joka on kirjattu 1 ms: n altistusajalla. Pikkukuvassa on edustava kehys. Jokainen väri vastaa yhtä havaituista kuudesta eri raidasta. h saman helmen Yksihiukkasseuranta grammoina ACsN-denooinnin jälkeen (pikkukuva). Parannettu SNR tuottaa paremman lokalisointitarkkuuden, joka johtaa yhteen, sileään lentorataan (musta viiva). I edustava kehys kaksitasoiselle yksihiukkasten seurannalle 1 kHz: n kuvataajuudella (valotusaika: 1 ms) ennen (vasen) ja (oikea) ACsN-denoinnin jälkeen. Asteikkotangot: 4 µm (a), 2 µm (c, e, i), 1 µm (g, pikkukuva), 250 nm (h).

yksimolekyylikuvauksen tavoin paikannustarkkuus yksihiukkasseurannassa (SPT) liittyy läheisesti Havaittujen fotonien määrään. Siksi yksi kriittinen tekijä, joka vaikuttaa saumattomien rauta-ja teräsputkien suorituskykyyn, on kuvatiedoston SNR37. Osoitimme, että ACsN: ää voidaan käyttää minimoimaan lokalisointivirheet, jotka ovat vastuussa hiukkasten virheellisestä tunnistamisesta ja virheellisistä liikeradoista (Kuva. 4g, h ja täydentävä elokuva 3). Tämä SNR-parannus johtaa parempiin hiukkasten paikannustarkkuuksiin, eli helmen sivuttaissiirtymän parempaan arviointiin alipikseliherkkyydellä. Tästä voi olla paljon hyötyä myös kaksitasoisessa SPT: ssä, jossa 3D-seurannan tarkkuus riippuu epätarkan image38: n laadusta (Kuva. 4i, täydentävä elokuva 4 ja täydentävä Huomautus 4.2).

Fluoresenssimikroskopia edullisilla CMOS-kameroilla

viime aikoina huipputason teollisuuskäyttöön tarkoitettujen CMOS-kameroiden edistysaskeleet ovat herättäneet tiedeyhteisön kiinnostuksen mahdollisuuteen lähestyä sCMOS-kameroiden suorituskykyä edullisemmalla hinnalla39, 40,41,42. On osoitettu, että tällaisia CMOS-kameroita voidaan käyttää SMLM imaging41,42. Pienempi kvanttitehokkuus ja suurempi lukuhäly kuitenkin rajoittavat kuvanlaatua ja yleistä käytettävyyttä kvantitatiiviseen biolääketieteelliseen tutkimukseen monilla alueilla. Haasteeseen vastaaminen asianmukaisella denoisointistrategialla tarjoaisi kriittisen ja oikea-aikaisen ratkaisun teollisen luokan kameroiden muuntamiseksi laajempiin kuvantamissovelluksiin. Täällä toteutimme ensimmäisen kerran ACsN: n korkealuokkaisella teollisuuskameralla laajakenttämikroskopiaan käyttäen sekä epi-että TIRF-valaistusta (Kuva. 5 A-h). Molemmissa kokoonpanoissa ACsN denoising paransi huomattavasti kuvanlaatua saavuttaen näkyvän yhteisymmärryksen sCMOS-kameran saamien kuvien kanssa (Supplementary Figs. 5 ja 6 sekä täydentävä Taulukko 2).

f-aktiinin TIRF-kuva kiinteässä BPAE-kennossa, otettu kuvataajuudella 38 Hz (valotusaika: 26 ms). b sama kuva A jälkeen ACsN denoising. c naudan kiinteän keuhkovaltimon endoteelisolun (bpae) mitokondrioiden Epi-fluoresenssikuvaus 38 Hz: n kehysnopeudella (valotusaika: 26 ms). d sama kuva C jälkeen ACsN denoising. E-h zoomattu-kuviin, jotka vastaavat A–d: n boxed-alueita, mikä osoittaa kuvanlaadun paranemisen ACsN-denoinnin jälkeen. Erityisesti tällainen parannus on verrattavissa sCMOS-sensoreilla otettuihin kuviin, jotka on esitetty täydentävissä viikunoissa. 5 ja 6. I, j kuvat elävissä adiposyyteissä (liposyyteissä) olevasta GFP-värjätystä kalseiinista, jotka on otettu edullisilla CMOS-arvoilla pienoismikroskopiaa varten ennen (i) ja (J) ACsN-denoisointia. Tiedot otettiin upottamalla miniskooppi elävien solujen viljelmään. K-N zoomattu – kuvat vastaavat boxed alueilla i ja j. o, p käyrät solurakenteiden poikkileikkausintensiteettiprofiileista ennen (harmaa) ja sen jälkeen (punainen) ACsN denoisointia katkoviivalla K, L ja m, n, vastaavasti. Asteikkotangot: 10 µm (a, c), 4 µm (e, g), 50 µm (i), 20 µm (k).

yksifotoninen eksitaatiopohjainen miniskooppi eli miniskooppi on kehitetty suorittamaan laajakenttäkalsiumkuvausta vapaasti käyttäytyvillä eläimillä43, 44, 45. Vaadittu pienennys saavutettiin korvaamalla yhdistelmäobjektiivit gradientti-indeksillä (GRIN) sauvaobjektiivilla, joka tarjoaa useita etuja, kuten edulliset kustannukset, kevyt paino ja suhteellisen suuri numeerinen aukko. Nämä miniskoopin ominaisuudet mahdollistavat minimaalisesti invasiivisen kuvantamisen merkittävästä aivotilavuudesta solutason resoluutiolla monimutkaisten käyttäytymiseen,kognitiivisiin ja emotionaalisiin tiloihin46,47, 48. Kuitenkin edullinen CMOS-anturi (MT9V032C12STM, Semiconductor, hinta ~$15) tällä hetkellä hyväksytty tuottaa huono kuvanlaatu, jotta saadaan suhteellisen korkea kuvannusnopeus, joka voi olla vakavasti rajoittavia laajempia sovelluksia solukuvauksessa. Tässä vahvistimme ACsN: n toteutettavuuden miniskooppianturille suorittamalla yhden fotonin herätepohjaisen, laajan kentän kuvantamisen GFP: n värjäämästä kalseiinista elävissä adiposyyteissä (Kuva. 5i-p).

selektiivinen tasovalomikroskopia

toisin kuin laajakenttämikroskopia, selektiivinen tasovalomikroskopia (spim) valaisee näytteen valolevyllä, joka on kohtisuorassa havaintosuuntaan nähden. Näin vältetään tarpeeton Valaistus, mikä mahdollistaa ennennäkemättömän pitkän aikavälin kuvantamisen dynaamisista biologisista näytekasveista49,50,51. Lattice light-sheet microscopy (LLSM) edelleen optimoi optisen järjestelmän valaisemalla näyte useita tasoaaltoja, jotka veistää etenemisvariantti optinen ristikko52. Vaikka uusia strategioita tutkitaan näytteisiin liittyvien kysymysten käsittelemiseksi 53,54, kameramelu on edelleen merkittävin rajoitus SPIM-ja LLSM-kuvantamisominaisuuksille niiden suhteellisen matalan taustasignaalin vuoksi.

osoitimme ensin, että ACsN denoising voi ylittää tämän rajoituksen suorittamalla spim-mittauksen kiinteistä suolavedessä olevista katkaravuista. Tässä, me parannettu itse samankaltaisuus käyttäen 3D harva suodatus pitkin skannaussuunnassa. Acsn-käsittelyn jälkeen havaitsimme, että melunvaimennus tekee näytteen yksityiskohdista paremman jokaisessa yksittäisessä viipaleessa (täydentävä Kuva. 7). Erityisesti kiinteän kuvion kohinan korjaaminen on erityisen havaittavissa enimmäisintensiteettiprojektiokuvissa (Fig. 6a, e ja täydentävä elokuva 5). Lisäksi on huomattavaa havaita selvää parannusta skannatun tilavuuden ortogonaalisissa poikkileikkauksissa (Kuva. 6b–d, f-h), mikä mahdollistaa näytteen 3D-rakenteiden paremman arvioinnin.

enimmäisintensiteettiprojektiot (MIP) spim-kuvista, joissa on fluoresoidusti merkitty AIKUINEN suolaliemikatkarapu ennen (a) ja jälkeen (e) ACsN-denoinnin. Ortogonaaliset näkymät raa ’ an (b–d) ja denooidun (f–h) volumetrisen skannauksen XZ-tasoa pitkin mitoilla y = 237 mm (b, f), y = 904 mm (c, g) ja y = 1491 mm (d, h). Viipaleita pitkin XY ja YZ taso on toimitettu täydentävä Kuva. 7. I kolmiulotteinen renderöinti elävien ihmisen keuhkosyöpäsolujen (NCI-H1299 NSCLC) hankittu LLSM ja käsitellään ACsN denoising. Zoomattu-kuvia alueen vastaa valkoista laatikkoa i ennen (j) ja jälkeen (k) acsn denoising. Vastaava aikarahdin jakso on esitetty täydentävissä elokuvissa 6 ja 7. MIP-kuvat ja edustavat viipaleet on kuvattu täydentävinä viikunoina. 9 ja 10. Asteikkotangot: 400 µm (A, e), 100 µm (b, f), 10 µm (i), 4 µm (k).

LLSM: n acsn-käsittelyn validoimiseksi kuvasimme ensin EGFP: llä keratiinia varten värjätyt kiinteät ihosolut eri altistusajoissa (5, 10 ja 20 ms) käyttäen jatkuvaa laservalaistustehoa 27 mW (mitattuna valaistustavoitteen takafokaalitasolta). Nämä kuvat hankittiin käyttäen näytteen skannaustila ja, näin, viipaleet oli deskewed hakea alkuperäiset kannat (KS.menetelmät). Suoritimme tällaisen operaation ennen ACsN denoising voidakseen hyödyntää itse samankaltaisuus pitkin z 3D harva suodatus. Havaitsimme, että kuvanlaatu voidaan säilyttää hyvin denoisoimalla jopa sen jälkeen, kun valotusaika on nelinkertaistunut (täydentävä Kuva. 8 ja täydentävä Taulukko 3).

lisäksi osoitimme acsn-kuvan palauttamisen time-lapse live-cell LLSM imaging-kuvantamisesta. Ensinnäkin kuvasimme eläviä ihmisen keuhkosyöpäsoluja (NCI-H1299 NSCLC) näytteen skannaustilassa 18.4 s: n välein yli 30 min (Kuva. 6i-k, täydentävä Kuva. 9, ja täydentävät Elokuvat 6 ja 7). Kuten edellä todettiin, näytteen skannaustila vaatii volumetristen viipaleiden deskewingiä, mikä lisää aineiston kokoa ja sitten käsittelyn monimutkaisuutta. Toisin kuin edellisessä tapauksessa, time-lapse-kuvantamisessa pystyimme kuitenkin hyödyntämään ajallista itsensä samankaltaisuutta, joka tuottaa tehokkaamman kohinakorjauksen kuin volumetrinen one55. Siksi estimme volumetriset skannaukset käsittelemällä kunkin siivun vastaavat aikapinot. Näin ACsN voitaisiin käyttää ennen deskewing, tehokkaasti säilyttää denoising suorituskykyä ja säästää laskennallisen ajan (täydentävä Kuva. 10). Seuraavaksi havaitsimme endogeenisen F-aktiinin liikkeen elävissä hiiren alkion fibroblasteissa llsm: n avulla sheet scan-tilassa (KS.menetelmät). Erityisesti tämä tila ei tuota mitään muutosta viipaleiden välillä, ja volumetrinen tieto voidaan hakea ilman deskewing (täydentävä Kuva. 11). Erityisesti filopodian liikettä ympäri solua voidaan havaita selkeämmin denoisoinnin jälkeen (täydentävä elokuva 8).