HPLC: n suorittaminen

käyttöönotto

korkean erotuskyvyn nestekromatografia on pohjimmiltaan erittäin parannettu kolonnikromatografian muoto. Sen sijaan, että liuottimen annettaisiin valua kolonnin läpi painovoiman alaisena, se pakotetaan läpi jopa 400 ilmakehän korkeissa paineissa. Se tekee siitä paljon nopeampaa.

sen avulla voidaan myös käyttää kolonnin pakkausmateriaalille hyvin paljon pienempää partikkelikokoa, joka antaa paljon suuremman pinta-alan stationäärifaasin ja sen ohi virtaavien molekyylien välisille vuorovaikutuksille. Tämä mahdollistaa paljon paremman erotuksen komponenttien seoksen.

toinen merkittävä parannus kolonnikromatografiaan verrattuna koskee käytettäviä detektiomenetelmiä. Nämä menetelmät ovat pitkälle automatisoituja ja erittäin herkkiä.

kolonni ja liuotin

Sekoittavasti HPLC: ssä on käytössä kaksi varianttia riippuen liuottimen ja stationäärifaasin suhteellisesta napaisuudesta.

Normaalifaasi HPLC

Tämä on käytännössä juuri sama, josta on jo luettu ohutkerroskromatografiassa tai kolonnikromatografiassa. Vaikka se on kuvattu ”normaali”, se ei ole yleisimmin käytetty muoto HPLC.

kolonni on täytetty pienillä piidioksidihiukkasilla ja liuotin on esimerkiksi ei-polaarinen heksaani. Tyypillisen kolonnin sisähalkaisija on 4,6 mm (ja se voi olla pienempi) ja pituus 150-250 mm.

kolonnin läpi kulkevan seoksen polaariset yhdisteet tarttuvat polaariseen piidioksidiin pitempään kuin ei-polaariset yhdisteet. Ei-polaariset kulkevat siis nopeammin pylvään läpi.

käänteisfaasi HPLC

tällöin kolonnin koko on sama, mutta piidioksidia muunnetaan polaarittomaksi liittämällä sen pintaan pitkiä hiilivetyketjuja-tyypillisesti niissä on joko 8 tai 18 hiiliatomia. Käytetään polaarista liuotinta – esimerkiksi veden ja alkoholin kuten metanolin seosta.

tällöin kolonnin läpi kulkevan seoksen polaarisen liuottimen ja polaaristen molekyylien välillä on voimakas vetovoima. Piidioksidiin (stationäärifaasiin) kiinnittyneiden hiilivetyketjujen ja liuoksen polaarimolekyylien välillä ei ole yhtä paljon vetovoimaa. Seoksen polaariset molekyylit viettävät siis suurimman osan ajastaan liikkuen liuottimen mukana.

Seoksessa olevat ei-polaariset yhdisteet tapaavat muodostaa vetonauloja hiilivetyryhmien kanssa van der Waalsin dispersiovoimien vuoksi. Ne myös liukenevat vähemmän liuottimeen, koska vetysidokset on katkaistava puristuessaan esimerkiksi vesi-tai metanolimolekyylien väliin. Siksi ne viettävät vähemmän aikaa liuoksessa liuottimessa, mikä hidastaa niiden kulkua kolonnin läpi.

tämä tarkoittaa, että nyt polaarimolekyylit kulkevat kolonnin läpi nopeammin.

käänteisfaasi HPLC on yleisimmin käytetty HPLC: n muoto.