absorptiospektri

tiamiinin absorptiospektri kirjattiin veteen (Kuva 1), todettiin, että tiamiinin absorptiopiikki (λ Max) on 235 nm: n aallonpituudella. Tiamiinin voimakkaasti sinisiirtyneen λ max: n vuoksi sen määritys annosmuodossa sen imeytymisen suoran mittauksen perusteella ultravioletille on altis yhteisistä APUAINEISTA mahdollisesti aiheutuville häiriöille. Siksi tiamiinin derivointi näkyvän kantaman absorboivien lajien saavuttamiseksi oli epäilemättä välttämätöntä. Näin suoritettiin tiamiinin derivointi NBD-Cl: llä ja tuotteen absorptiospektri kirjattiin reagenssin nollaa vastaan (Kuva 1). Todettiin, että tuote on ruskean värinen näyttäen λmax 434nm: ssä, ja NBD-Cl: n λmax oli 342nm. Tiamiini-NBD-Cl-johdannaisen λmax punasiirtyi, jolloin mahdolliset häiriöt poistuivat. Aallonpituus 434 nm vahvistettiin siten optimaaliseksi.

reaktio-olosuhteiden optimointi

kuva 1: tiamiinin Absorptiospektrit (3), NBD-Cl (2) ja niiden välinen kompleksi (1).

kehitetyn menetelmän optimaaliset olosuhteet määritettiin muuttamalla parametreja yksi kerrallaan pitäen muut parametrit vakiona ja seuraamalla värillisen tuotteen absorbanssiin kohdistuvaa vaikutusta. Koeolosuhteiden määrittämiseksi tutkittiin erilaisten parametrien, kuten pH: n, ajan, puskuritilavuuden ja NBD-Cl: n pitoisuuden, vaikutusta.

pH: n vaikutus

pH: n vaikutusta tiamiinin ja NBD-Cl: n väliseen reaktioon testattiin vaihtelemalla pH-muotoa 7, 0-12, 0. Kuten kuviosta 2 käy ilmi, tuotteen absorbanssi on alhainen pH 7,0: ssa, mikä viittaa siihen, että tiamiini ei voi reagoida (NBD-Cl): n kanssa neutraaleissa väliaineissa. Tämä johtui mahdollisesti tiamiinin aminoryhmän olemassaolosta hydrokloridisuolana, mikä vaikeuttaa nukleofiilista substituutiokykyä. PH: n noustessa 7: stä 12: een lukemat nousivat dramaattisesti vapauttaen tiamiinin aminoryhmän ja helpottaen nukleofiilista substituutiota. Maksimiabsorptio saavutettiin pH-arvolla 10, 5. Kun pH-arvo oli yli 10, 5, imeytyminen väheni. Tämän katsottiin todennäköisesti johtuvan hydroksidi-ionin määrän kasvusta, joka kiihdyttää tiamiinin takaperin tapahtuvaa reaktiota NBD-Cl: n kanssa.

reaktioajan vaikutus

reaktiotuotteen absorbanssia seurattiin eri aikoina (kuva 3). Muiden olosuhteiden säilyessä ehjinä reaktiotuotteen absorbanssia seurattiin sen jälkeen, kun se oli seissyt eri aikajänteillä 25°C: ssa.tulokset osoittavat, että tiamiini reagoi NBD-Cl: n kanssa 25°C: ssa ja absorbanssi alkaa kasvaa vähitellen ja saavuttaa maksiminsa 25 minuutin kuluttua. Pidemmillä reaktioajoilla havaittiin hienoista absorbanssin laskua. Näin ollen 25min asetettiin sopiva reaktioaika määritykseen.

puskurin määrän vaikutus

kuva 2: pH: n vaikutus tiamiinin reaktioon NBD-Cl: n kanssa.
tiamiini (20µg/ml): 1 ml, NBD-Cl conc. 0, 2% (w/v), reaktioaika 20 min.

kuva 3: reaktioajan vaikutus tiamiinin reaktioon NBD-Cl: n kanssa.
tiamiini (20µg/ml): 1 ml, Puskuri (pH 10.5): 1, 5 ml, NBD-Cl conc. 0, 2% (w / v).

pH: n ollessa 10, 5, tutkittiin myös puskuriliuoksen määrän vaikutusta reaktiotuotteen absorbanssiin (Kuva 4). Kuviosta käy ilmi, että reaktiotuotteen absorbanssi paranee nopeasti puskuriliuoksen määrän kasvaessa ja tulee maksimaaliseksi, kun puskuriliuoksen määrä saavuttaa 1, 5 mL. Siksi valittiin 1, 5 mL: n puskuriliuos, jotta varmistetaan suurin absorbanssi.

NBD-Cl-pitoisuuden vaikutus

NBD-Cl-pitoisuuksien vaikutusta koskeva tutkimus osoitti, että reaktio oli riippuvainen reagenssipitoisuudesta. Suurin absorptiovoimakkuus saavutettiin NBD-Cl-pitoisuudella 0, 2% (w/v), ja suurempi NBD-Cl-pitoisuus johtaa absorbanssin vähenemiseen (kuva 5).

edellä mainittujen parametrien säätökokeiden perusteella määrityksessä käytetyt optimoidut olosuhteet olivat: pH 10, 5, NBD-Cl-pitoisuus 0, 2% (w / v), puskurin tilavuus 1, 5 mL, reaktioaika 25min ja lämpötila 25ºC.

kuva 4: Puskurimäärän (ml) vaikutus tiamiinin reaktioon NBD-Cl: n kanssa.
tiamiini (20µg/ml): 1 ml, Puskuri pH: 10, 5, NBD-Cl conc. 0, 2% (w / v), reaktioaika 25 min.

kuva 5: NBD-Cl-pitoisuuden vaikutus sen reaktioon tiamiinin kanssa.
tiamiini (20µg/ml): 1 ml, Puskuri (pH 10, 5): 1, 5 ml, reaktioaika 25 min.

menetelmän validointi

menetelmä validoitiin seuraaville parametreille: specificity, linearity, precision, accuracy, limit of detection (Lod), limit of quantitation (LOQ), and robustness the International Conference on Harmonization (ich) guidelines .

lineaarisuus, havaitsemisraja (Lod) määritysraja (LOQ)

lineaarisuus arvioitiin lineaarisella regressioanalyysillä, joka määritettiin muodostamalla seitsemän tiamiinipitoisuutta alueella 05–35µg / mL, mikä laskettiin pienimmän neliön regressiomenetelmällä kalibrointiyhtälön ja korrelaatiokertoimen laskemiseksi. Kalibrointikäyrät muodostettiin piirtämällä konsentraatio absorbanssiin lineaarisen regressioanalyysin avulla. Tulosten regressioyhtälö oli A=0, 033 x-0, 009 (r2=0, 999), jossa A on absorbanssi 434 nm: ssä, x on tiamiinin konsentraatio µg/mL alueella 05-35 µg/mL ja r on korrelaatiokerroin (Taulukko 1). Todettiin, että lineaarinen pitoisuusalue on verrattavissa aiempaan menetelmäämme, jossa käytettiin NQS: ää . Toteamisraja (Lod) ja kvantifiointiraja (LOQ) määritettiin seuraavalla kaavalla LOD=3.3×SDA/b ja LOQ=10×SDA / b, SDa on leikkauspisteen keskihajonta; b on kulmakerroin ICH-ohjeissa . Määritysraja oli 0, 667 µg/mL ja määritysraja 2, 020 µg / mL (Taulukko 1).

tarkkuus

ehdotetun menetelmän tarkkuus toteutettiin soveltamalla kolmea eri pitoisuutta 10, 20 ja 30 µg / mL tiamiinilääkettä lineaarisella alueella, joka laskettiin näytteistä otetun lääkeaineen prosenttiosuutena (Taulukko 2).

suhteellinen virhe (RE) oli 0, 24%: n sisällä ja vastaava keskihajonta 0, 004: n sisällä kolmessa eri määrityksessä (Taulukko 3).

Robustness

Reaktiomekanismi: on raportoitu, että NBD-Cl reagoi primääristen tai sekundääristen amiinijohdannaisten aminoryhmän kanssa . Vastaavasti tiamiinin aminoryhmä voi toimia nukleofiilina typpiatomin yksinäisen elektroniparin vuoksi, joka pyrkii hyökkäämään NBD–Cl: n elektronipuutteista keskusta vastaan (Taulukko 4 & kuva 6). Samalla on osoitettu, että tuotteen koostumus on 1:1 tiamiinia ja NBD-Cl (Kuva 7). On siis päätelty, että tiamiinin aminoryhmä reagoi NBD-Cl: n kanssa muodostaen ruskean adduktin. Reaktioyhtälö on esitetty kuvassa 7.

kuva 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

ehdotetun menetelmän soveltaminen tiamiinin annostusmuodon määritykseen

Tiamiinitabletit analysoitiin ehdotetulla tavalla ja etiketin väite sopii hyvin yhteen uuden menetelmämme kanssa, kuten on esitetty taulukossa 5. Ehdotetun menetelmän etuna on se, että se on käytännöllisesti katsoen vapaa apuaineiden aiheuttamista häiriöistä.

Figure 7: Tiamiinin reaktio NBD-Cl:n kanssa osoittaa 1: 1 stoikiometrian.