kasviaineisto

vuosina 2011-2018 Louvain-la-Neuven yliopiston koepuutarhassa kasvatetuista kasveista (50°39’55″N; 4°37’11″E). Ennen kukkimisjaksoaan ja sen aikana (heinä–elokuu) kasvit sijoitettiin yliopiston kasvukammioihin valvotuissa olosuhteissa (24/22 °c; 16 L:8D, RH 80 ± 10%).

Hyönteismateriaalia

pääasiallista hyönteisvieraslajia A. napellusta (A. mellifera, B. pascuorum ja B. terrestris) käytettiin kokeissa kukkien houkuttelevuudesta ja makuelämyksestä. A. mellifera-ja B. pascuorum-yksilöt (10 yksilöä testiä ja hoitoa kohti) kerättiin luonnosta yliopistokampuksen ympäristöstä (vähintään neljä paikkaa lajia kohti) aamulla ennen testejä. Kuten B. terrestris yksilöitä ei ole helppo erottaa alalla (samanlainen morfologia useita lajeja), käytimme kimalaisia neljästä pesistä (Biobest, Westerloo, Belgia) sijoitettu läheisyydessä yliopiston rakennuksia saada yksilöitä kokeiltavaksi.

kukkaperät

siitepölymäärät

10 kukan hede-ja emikukinnot kerättiin, laskettiin, kuivattiin ja asetettiin seulaan (90 µm), jota hierottiin siitepölyhiukkasten keräämiseksi. Siitepölyhiukkasten määrä punnittiin. Siitepölymääritykset tehtiin Lille-1-yliopistossa (Evo-Eco-Paleo-yksikkö). Käytimme hiukkaslaskuria arvioidaksemme siitepölyhiukkasten määrää näissä näytteissä. Siitepölymääriä edeltävänä päivänä näytteitä laitettiin putkilämmittimeen, kunnes suurin osa etanolista haihtui. Sitten pakotimme toisenkin poiston laittamalla näytteet uuniin 56 °C: seen yön yli. Jokaiseen siitepölynäytteeseen lisättiin 1 mL tislattua vettä. Tämän jälkeen putkia sonikoitiin ja pyörrettiin, jotta siitepölyhiukkaset erottuisivat toisistaan. Siitepölyliuos (200 µL) laimennettiin 5 mL: aan isotonista mittauspuskuria (CASY® ton). Hiukkaslaskuri analysoi siitepölysuspensiosta kolme 400 µL: n näytettä, jolloin saatiin kokonaishiukkasmäärä tässä 1200 µL: n tilavuudessa sekä lukemat 400 kokoluokassa 0,125-150 µm. Vertailemalla nollanäytteitä pystyimme tunnistamaan hiukkaspiikkejä, joiden koko vaihtelee 20-30 µm: n välillä, mikä vastaa siitepölyhiukkasia. Siitepölyhiukkasten määrä per Anteri estimoitiin kertomalla hiukkaslaskurin antamat arvot laimennussuhteella (ts.(1000/200) × (5000 + 200)/1200).

Kukkien väri ja morfologia

mitasimme kukan piirteitä (teriön pituus, teriön halkaisija, kukan väri ja UV-heijastuma) 10 kukasta per vaihe (10 eri yksilöstä). Kypärän leveys, teriön pituus ja halkaisija mitattiin kalliolla. Mittasimme tepal – väriheijastusspektrin valokuitupektrometrillä (Avapec-ULS2048) ja ksenon-pulssisella valonlähteellä (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Alankomaat). UV-heijastusmittauksia varten kukat kiinnitettiin mustalle taustalle ja valokuvattiin Nikon D40: llä (rannikon optinen 60 mm 1:4 UV-VIS-IR ApoMacro; Filtre X-Nite 330).

Flower volatile collection

otimme haihtuvia orgaanisia yhdisteitä (VOC) ehjistä hede – ja emifaasikukista (N = 4 kullekin faasille). Jokainen kukka oli erikseen asetettu lasiseen (pituus 50 mm ja halkaisija 30 mm), jossa oli halkaisijaltaan 17 mm aukko. Ilman saastumisen estämiseksi lasikupun toiseen päähän liitettiin yksi aktiivihiilellä täytetty Teflonputki ja toiseen päähän kaksi lasista Tenax TA-putkea (6 mm × 4 mm, 7 tuumaa; 60-80 mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgia). Tenax-putket oli kytketty kalibroituihin ilmapumppuihin (Gilair plus, Sensidyn, St. Petersburg, USA) virtausnopeudella 50 mL·min−1 180 min (klo 11:00-14:00 h). Laboratorio-olosuhteet vaihtelivat välillä 21, 5-23, 5 °C ja 45-55% RH.

vangitut VOC−yhdisteet desorboitiin termisesti Agilent 6800-kaasukromatografiin, johon oli asennettu Gerstel TDU-termodesorptioyksikkö ja CIS-kryojäähdytin, joka pidettiin -50 °C: ssa.heti termodesorption jälkeen CIS-yksikkö T° ohjelmoitiin -50 °C: sta 300 °C: seen 12 °C: n lämpötilassa sec-1. GLC-laite oli kytketty Agilent 7975 C-massaspektrometriin. Analyyttiset olosuhteet olivat seuraavat:jakotilan ruiskutus (jakosuhde 50: 1, helium kantokaasuna 1, 6 mL min−1), VF-Max MS 30 m x 250 µm (df = 0, 25 µm) kolonni (Agilentti). Lämpötilaohjelma, joka mahdollisti parhaan erotuksen (alustavia testejä ei näytetty), vahvistettiin seuraavasti: 40 °C (5 min) sitten 75 °C: seen 4 °c min−1: ssä ja 115 °C: seen (3 °c min−1) ja lopulta 250 °C: seen 13 °c min−1: ssä. MS-ehdot olivat seuraavat: EI-tila 70 eV: n lämpötilassa, lähde T° = 250 °C, MS quadrupole 200 °C: n lämpötilassa ja skannattu massa 35-500 amu.

kirjatut kromatogrammit tulkittiin systemaattisesti etsimään VOC-yhdisteitä, jotka ovat ominaisia mies-tai naisfaaseille. Havaittaessa molekyylit tunnistettiin laskennallisten tietokantojen (Wiley 250.L ja PAL 600). Tunnistetiedot vahvistettiin kaupallisesti saatavilla olevien puhtaiden molekyylien retentiotietojen perusteella. Ne kvantifioitiin myös suhteessa erittäin puhtaaseen sisäiseen standardiin (limoneeni, 1 µL metanoliliuosta arvolla 0.67 µg µL1 lisätään automaattisesti kuhunkin desorptioputkeen ennen lämpöprosessia).

Taustakontaminanttien tunnistamiseen käytettiin kontrollina myös ulkoilmaa. Mahdollisen läpimurron estämiseksi samalla adsorbentilla (Tenax TA) ladattu toinen lasinen sylinteriampulli asetettiin järjestelmällisesti rinnakkain. Analyysissä ei löytynyt jäämiä kiinnostavista molekyyleistä.

alkaloidien kerääminen ja analysointi

Anthers kerättiin 50 kukasta (10 yksilöstä), kuivatettiin ja sitten murskattiin seulan (90 µm) avulla siitepölyhiukkasten keräämiseksi. Kolmesta 15 mg: n siitepölymäärästä otettiin alkaloideja. Näytteitä pakastettiin (-80 °C) 2 tunnin ajan, minkä jälkeen ne pakastettiin. Kuivat näytteet jauhettiin hienoksi jauheeksi, jossa oli nestemäistä typpeä, ja punnitut määrät jauhetta laitettiin 1,5 mL: n mikrosentrifugiputkeen (Eppendorf, Hampuri, Saksa). Alkaloidit uutettiin kudoshomogenisaattorilla (VWR Ultrasonic Cleaner) 10 minuutin ajan 100 µL: ssa uuttopuskuria (70% metanolin vesiliuosta ja 0,5% muurahaishappoa). Sentrifugoinnin jälkeen nopeudella 12 000 rpm 5 minuutin ajan (sentrifugi 5430 R) supernatantti siirrettiin 1,5 mL: n mikrosentrifugiputkeen. SpeedVac-kuivauksen jälkeen alkaloidit suspendoitiin uudelleen 200 µL: aan LC-MS-luokan metanolia ja suodatettiin 0,45 µm PTFE-ruiskusuodattimella (Whatman).

mesiäinen kerättiin 5-µL lasisiin kapillaariputkiin (Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Saksa) 50 kukasta (10 yksilöstä). Kolme toisintoa, joissa oli 15 µL nektaria, kuivattiin Speedvacissa ja suspendoitiin uudelleen 200 µL LC-MS-luokan metanolia ennen suodatusta 0,45 µm PTFE-ruiskusuodattimella (Whatman).

kemialliset analyysit tehtiin käyttäen LC-MS / MS-järjestelmää, joka koostui Thermo Accelap-pumpusta, autosamplerista, fotodiodirivistöilmaisimesta ja Thermo Scientific LTQ orbitrap XL-massailmaisimesta (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Woluwe, Belgia). Käytettiin Phenomenex Gemini C18-kolonnia (2 mm × 150 mm, pakattu 3-µm hiukkasiin). Käytettiin binääristä liuotinjärjestelmää, jonka virtausnopeus oli 300 µL min−1: liuotin a, HPLC-luokan vesi (0,1% muurahaishappoa) ja liuotin B, LC-MS-luokan metanoli (0 min: 95% a, 10-12 min: 0% a, 13-17 min: 95% a). Injektoitiin 10 µL: n tilavuus ja kolonnin lämpötila asetettiin 30 °C: seen.korkean resoluution MS suoritettiin elektrospray-ionisaatiolähteellä positiivisessa tilassa. Seuraavia sisääntuloolosuhteita sovellettiin: kapillaarilämpötila, 275 °C; kapillaarijännite, 13 V; putkilinssi, 140 V; vaippakaasuvirta, 30 a.u.; ja apukaasuvirta, 10 u.A. tiedonkeruu ja-käsittely suoritettiin Xcalibur-ohjelmistolla. Tämä menetelmä kattoi kaikkien alkaloidien massan alueen (MW 329-673). Siitepölystä ja medestä peräisin olevia alkaloideja havaittiin ja alustavasti tunnistettiin korkearesoluutioisella MS-taudilla. Törmäyksen aiheuttamalla dissosiaatiolla saatu fragmentaatio auttoi tunnistamisessa. Alkaloidipitoisuudet laskettiin MeOH: n akonitiinistandardikäyrän perusteella ja ilmaistiin ”akonitiiniekvivalenttina”. Analysoidut alkaloidit valittiin sen perusteella, että niitä esiintyy muissa akonitum-lajeissa4, 8.

nektarin tuotanto ja sokerikoostumus

nektaria kerättiin 5-µL lasisiin kapillaariputkiin (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Saksa) yliopiston kampuksen kasvukammioissa siirrettyjen kasvien kukista (ei hyönteisvierailuja). Arvioimme meden tuotantosuuntaa päivän aikana antesiksen alussa ottamalla näytteitä 2 kukasta 12 yksilöstä 2 tunnin välein 10 tunnin aikana. Mittasimme myös meden kokonaistuotannon kukkaa kohti (2 kukkaa 12 yksilöstä) samoista kukista joka 2.Päivä Koko (9 päivää) kukan eliniän ajan, samaan aikaan joka päivä, 2 tuntia valon syttymisen jälkeen. Uros – ja naarasvaiheiden kokonaistuotanto arvioitiin urosvaiheiden (5 päivää anteesin jälkeen) ja naarasvaiheiden (8 päivää) lopussa otettujen näytteiden perusteella.

Mesinäytteitä säilytettiin -80 °C: n lämpötilassa, kunnes kemialliset analyysit tehtiin. Derivoinnin jälkeen sokerin tunnistus ja kvantifiointi suoritettiin GC-MS: llä (Thermo Trace 1310 /Thermo ISQ-QD). Käytettiin Restek Rxi-5sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 µm DF) – kolonnia. Virtausnopeus oli 1,0 mL min−1 (helium). Ruiskutetut jakosuhteet olivat heksoosien osalta 1/10 ja sakkaroosin osalta 1/100. Syöttöolosuhteet olivat seuraavat: uunin lämpötila 105 °C 4 min, sitten 280 °C 15 °c min−1 (20 min) ja injektorin lämpötila 250 °C.Tämän jälkeen laskettiin meden kokonaissokeripitoisuus kukkaa kohti (mg) meden tilavuutena (µL) x kokonaissokeripitoisuus (mg/µL).

hyönteisten käyttäytymistä

vuosina 2011 ja 2012 tehtiin tutkimuksia neljällä jäljellä olevalla luonnollisella populaatiolla fensissä Etelä-Belgiassa. Näistä luonnonsuojelualue” Les Abattis”(49°40’50″N; 5°32’59” E) sisältää suurimman ja tiheimmän populaation (2970 m2 ja 1330 ± 1030 A. napelluksen Kukat m−2). At ”Fouches” (49°4’8″N; 5°43’06″E), joka on toiseksi suurin populaatio (1788 m2), yksilöitä A. napellukset olivat hyvin hajallaan alueella ja paljon pienemmillä tiheyksillä (176 ± 177 kukkaa m−2) ”Chantemelle”(49°39′ 37″N; 5°39’37” E) ” oli epäjatkuva populaatio, joka koostui kolmesta laikusta (161, 423 ja 500 m2), joilla oli suhteellisen alhainen kasvi−ja kukkatiheys (179 ± 125 kukkaa m-2). ”Sainte−Mariella” (49°40’06″N; 5°32’56″E) oli pieni ja hajanainen populaatio (292 m2, 152 ± 163 kukkaa m-2), joka ulottui noin 150 metrin päähän entisestä rautatiestä.

Kukintavieraita kirjattiin 10 minuutin mittaisina havaintoina huippukukinnan aikana kolmena peräkkäisenä päivänä vuonna 2011 (30.elokuuta-3. syyskuuta) ja neljänä päivänä vuonna 2012 (21. -27. elokuuta) kuivilla ja lämpimillä keleillä. Hedekukkien osuus oli näinä päivinä ja kaikissa populaatioissa suurempi kuin emikukkien osuus (noin 85%). Kukkia 1 m2 (tai noin viisi kasvia) havaittiin samaan aikaan. Populaatiota kohti tehtiin vähintään kymmenen havaintoa (enintään 16), jotka jakautuivat koko populaatioon ja eri vuorokaudenaikoihin. Jokaisesta kävijästä kirjattiin laji, tarkastettujen ja tarkastamattomien kukkien lukumäärä kasvia ja laikkua kohti, kuhunkin kukkaan käytetty aika sekä niiden ravinnonhankintakäyttäytyminen (siitepölyn tai meden kerääminen, laillinen tai laiton käynti, josta käytetään nimitystä ryöstö (base-working, primary and secondary robbing). 530 min kukkahavaintojen aikana vuonna 2011 ja 400 min vuonna 2012 kirjasimme 183 kukkaiskävijää. Kimalaiset (B. pascuorum ja B. hortorum) ja mehiläiset (Apis mellifera) olivat tärkeimpiä kukkien kävijöitä; vain 3 B. terrestris-yksilöä havaittiin.

siitepölyn kantokyky

kolmekymmentä yksilöä per laji tapettiin etyyliasetaatilla, ja ne varastoitiin yksittäin. Siitepölyä poistettiin hyönteisten eri ruumiinosista pienillä kuutioilla liivatetta-glyseriini53. Corbiculaan keskittyneet siitepölyhiukkaset poistettiin, eikä niitä otettu mukaan analyyseihin. Kaikki siitepölyhiukkaset laskettiin valomikroskoopilla.

Siitepölykokoelman puhtaus

otimme näytteitä A. napelluksen luona käyvien kimalaisten siitepölykuormista luonnollisissa populaatioissa. Laboratoriossa siitepölykuorma asetolysoitiin 53. Vähintään 400 satunnaisesti valittua siitepölyhiukkasta jokaisesta 25 siitepölykuormasta tunnistettiin ja laskettiin valomikroskoopilla.

Hyönteisvieraiden antoisia vastauksia

noudatimme Ma et al: n protokollaa.54 akonitiinin osoittamiseen. Kun mehiläiset saatiin kiinni, niitä pidettiin nälässä 3 tuntia muovisessa injektiopullossa (7 cm pitkä, sisähalkaisija 2,8 cm) huoneenlämmössä ja täydessä pimeydessä laboratoriossa. Siirsimme jokaisen mehiläisen pitoputkeen, 15 mL: n sentrifugiputkeen, jonka kärkeen oli porattu 4 mm: n reikä ja sen sisään oli kiinnitetty teräsverkon pala. Esitestivaiheen jälkeen, jossa oli pisara sakkaroosia, esitimme testiliuoksen 100 µL: n lasisessa kapillaariputkessa ja puristimme letkua varovasti, jotta liuos pysyisi putken kärjessä. Kaikki hyönteiset, joilla ei ollut kouristuslaajennusta 5 minuutin kuluttua, poistettiin testistä. Testivaiheet olivat 2 minuutin mittaisia, ja liuoksen tilavuus ennen testiä ja sen jälkeen kirjattiin kellukkeella.

kokeita tehtiin kolmella vieraslajilla (A. mellifera, B. pascuorum ja B. terrestris). Jokaisella liuoksella testattiin kymmenen yksilöä hyönteislajia kohti. Sakkaroosin (430 µg mg−1) ja akonitiinin (232 µg g−1) pitoisuudet vastasivat lajissamme esiintyviä pitoisuuksia. Kolme liuosta esiteltiin: deionisoitu vesi yksin (kontrolli), puhdas sakkaroosiliuos ja sakkaroosi plus akonitiiniliuos.

kaikissa testeissä kullekin koehenkilölle laskettiin ehkäisyindeksi juomavalinnasta, juodun liuoksen määrästä ja kosketusajankohdasta seuraavasti: ID = 1 – (sakkaroosin valinta/sakkaroosin valinta + akonitiini) × (sakkaroosin kulutus/sakkaroosin kulutus + akonitiini) × (sakkaroosiliuoksen kanssa kosketusaika/sakkaroosin kanssa kosketusaika + akonitiiniliuos).

tilastolliset analyysit

tietojen normaalius arvioitiin Shapiro–Wilk-testeillä ja homoskedastisuus varmistettiin Levenen testeillä. Kun normaalius-ja homoskedastisuusvaatimukset täyttyivät, tehtiin varianssianalyysit (anovas) (kukka-faasi-vaikutus kukka-haihtuviin aineisiin). Muussa tapauksessa ei-parametriset testit suoritettiin Wilcoxonin testillä kahden tilan vertailua varten (kukka-faasin vaikutus kukan morfologiaan ja nektariiniparametreihin) ja Kruskall-Wallisin testillä useamman kuin kahden tilan vertailua varten (hyönteisten ja liuoksen vaikutus kulutettuun tilavuuteen ja kosketuksen kestoon liuoksella makukokeissa, hyönteisten vaikutus vierailukäyttäytymiseen) ja khiin neliötesteillä yksilöiden prosenttiosuuksien vertailemiseksi makukokeissa. ANOVA-ja ei-parametrisia analyysejä seurasi moniparivertailu, kun vertailtiin useampaa kuin kahta ehtoa. Kaikki analyysit tehtiin SAS: n Yritysoppaassa 7.1. Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskihajonta.